内质网在蛋白质生物合成和钙稳态的关键作用。我们已经建立了一个实验系统,使我们能够解决的Ca2 +泄漏通道的作用,并表征其公认的监管机制。该系统涉及的siRNA介导的基因沉默和活细胞内Ca2 +成像。
在哺乳动物细胞内质网(ER),起着关键作用在蛋白质生物合成以及钙信号 1 。在ER膜的异三聚体Sec61复杂提供了一个新进入管腔内质网合成的多肽水溶液的路径。最近从不同的实验室的工作表明,这种异源复杂,也可能形成瞬变的Ca 2 +泄漏通道 2-8 。重点观察这个概念是从核糖体和Sec61复杂的嘌呤导致瞬态释放的Ca 2 +从内质网,新生多肽的释放。此外,它已在体外观察,二管腔蛋白BIP是防止Sec61 复杂 9,10水平的离子通透性。我们已经建立了一个实验系统,使我们能够直接解决Sec61复杂的潜在的Ca 2 +泄漏通道的作用,并描述其公认的监管机制 11-13 。该系统结合的siRNA介导的基因沉默和活细胞的Ca 2 +影像13。细胞被视为是对编码和非编码区(UTR),分别在SEC61A1基因或负对照siRNA定向的siRNA 。互补分析,共同的细胞转染与IRES – GFP的抗性的野生型SEC61A1基因的siRNA表达载体,让。然后装入细胞与比例的Ca 2 +指标FURA – 2监测同时改变胞浆的Ca 2 +通过荧光显微镜观察细胞的数量,浓度。胞浆钙的连续测量 +还允许的各种药物的影响,如嘌呤,小分子抑制剂,毒胡萝卜素, 对Ca 2 +漏评价。这个实验系统为我们提供了独特的机会,以便i)评估在各种细胞类型,II的ER,不同的ER膜蛋白的贡献 ,从被动的Ca 2 +外流)特征的蛋白质和机制,限制了这种被动的Ca 2 +外流,并iii)研究疾病联系在一起的相关组件中的突变的影响。
在哺乳动物细胞内质网(ER)中起着关键作用在蛋白质生物合成以及钙信号。在这里,我们描述了一个实验系统,使我们能够直接解决一个潜在的Ca 2 +泄漏通道的作用,并表征其公认的13个监管机制。这个实验系统为我们提供了独特的机会,以便i)评估在各种细胞类型,II的ER,不同的ER膜蛋白的贡献 ,从被动的Ca 2 +外流)特征的蛋白质和机制,限制了这种被动的Ca 2 +外流,并iii)研究疾病联系在一起的相关组件中的突变的影响。
我们注意到,唯一可行的细胞进行分析,并应在80%以上,整体可行性。因此,细胞活力,定期评估采用核ID蓝色/绿色的细胞活力试剂,根据制造商的协议。此外,在胞浆钙的变化进行统计分析+浓度是强制性的。因此,实验要进行四个不同批次的细胞和两个盖玻片必须为每个在一个单一的实验条件分析至少有20个细胞。我们注意到,在盖玻片后播种的同时,要进行各种实验。
The authors have nothing to disclose.
SL是从东风集团(研究生研究学院845)的奖学金支持。这项工作是由东风集团(SFB的530/C1&967)赠款,由HOMFOR支持。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
DMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 31966 |
OptiMEM+GlutaMAX | Invitrogen | 51985 |
FBS | Biochrom | S0115 |
Penicillin/ Streptomycin | PAA | P11-010 |
HiPerFect | Qiagen | 301707 |
Fugene HD | Roche Diagnostics | 04709713 |
Nuclear-ID Blue/Green cell viability reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-53004 |
FURA-2 AM | Invitrogen | F-1221 |
Puromycin | Sigma | P 7255 |
Thapsigargin | Invitrogen | T-7459 |
Ophiobolin A | Enzo Life Sciences | ALX-270-109 |
Trifluoperazine | Sigma | T 6062 |
Countess® Automated Cell Counter | Invitrogen | |
Typhoon-Trio imaging system | GE Healthcare | |
TE2000-S microscope with DS-5Mc camera | Nikon | |
iMIC microscope with polychrome V | Till Photonics |