मच्छर के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक कैल्शियम bioluminescence परख ( एडीज aegypti) और (टिक Rhipicephalus microplus) जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स

Summary

इस प्रोटोकॉल clonal सेल लाइन चयन और एक कैल्शियम bioluminescence परख करने के लिए अपने आत्मीय GPCRs पर संश्लेषित सन्धिपाद neuropeptides की संरचना गतिविधि संबंध का विश्लेषण के लिए निर्देश प्रदान करता है है. इस परख रिसेप्टर और सिंथेटिक अनुरूप डिजाइन और / पेप्टाइड खोज दवा नेतृत्व के लिए deorphanization संरचना गतिविधि संबंध अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.

The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.

This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

Protocol

1. स्थिर सेल लाइनों की स्थापना ब्याज की अपने GPCR क्लोन और यह एक अभिव्यक्ति एक स्तनधारी प्रणाली में इष्टतम ribosomal बंधन (Kozak, 1986) के लिए शुरू codon के चारों ओर एक 5 'Kozak सर्वसम्मति अनुक्रम (/ GCCA GCCATGG) को शामिल सदिश में सम्मिलित. यहाँ हम मच्छर kinin (रिसेप्टर. Pietrantonio एट अल, 2005. होम्स एट अल, 2003) के लिए टिकटिक kinin रिसेप्टर के लिए प्लाज्मिड pcDNA3.1/Bm-KR, और प्लाज्मिड pcDNA3.1/Aedae-KR का उपयोग करें . (-) pcDNA3.1 वेक्टर बैक्टीरिया और स्तनधारी कोशिकाओं में चयन के लिए neomycin प्रतिरोध (G418) में चयन के लिए एम्पीसिलीन प्रतिरोध encodes. चो – K1 खाली plasmids () के बिना कोशिकाओं (ATCC, Manassas, VA, संयुक्त राज्य अमरीका) या एक T-25 फ्लास्क में अन्य इच्छित सेल लाइन (बी फाल्कन) 37 ° सी में एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर (होम्स एट अल आगे बढ़ें , 2003). सभी आगे incubations इन शर्तों के तहत किया जाना चाहिए जब तक अन्यथा निर्दिष्ट. मध्यम विकास में खाली कोशिकाओं के साथ (10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ F12K मध्यम) का रखरखाव 1X एंटीबायोटिक Antimycotic (Invitrogen, सीए). कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सभी समाधान गर्म T-25 फ्लास्क में पुराने मध्यम निकालें और 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कुल्ला और फिर पीबीएस हटायें. कोशिकाओं trypsinize 2 मिलीलीटर पीबीएस – trypsin – EDTA (34 मिलीलीटर PBS, 2 मिलीलीटर 7.5% सोडियम बिकारबोनिट, 4 मिलीलीटर 10X trypsin EDTA), 2 मिनट के लिए जोड़ें. 3 मिलीलीटर मध्यम जोड़ें और मध्यम aspirate ऊपर और नीचे करने के लिए कोशिकाओं मिश्रण. एक चोटीदार ट्यूब और ~ 200-300 ग्राम (1000 rpm) में 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं के साथ मध्यम स्थानांतरण. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 5 मिलीलीटर माध्यम से फिर से निलंबित कोशिकाओं. ताजा माध्यम के साथ 1:05 या 1:10 के एक एकाग्रता को resuspended कोशिकाओं पतला और एक नई T-25 फ्लास्क में 5 मिलीलीटर हस्तांतरण. बाद कोशिकाओं को स्वस्थ बढ़ रहे हैं (2-3 दिनों के चारों ओर), बीज T-25 टिशू कल्चर बोतल में चो-K1 कोशिकाओं और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना उन्हें मध्यम विकास में रात बढ़ने जब तक वे के बारे में 30% (लगभग 18 घंटे) मिला हुआ हैं. confluency की डिग्री उल्टे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत देख कोशिकाओं द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. प्रत्येक नमूना के लिए निम्नलिखित मिश्रण तैयार: 100 μl Opti सदस्य मैं सीरम मध्यम (Invitrogen) कम: 1-2 μg डीएनए (265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR का उपयोग 4μl उदाहरण के लिए) का मिश्रण. 100 μl F12K सीरम मुक्त माध्यम में 6 μl Lipofectin अभिकर्मक (InvitrogenTM) मिक्स, डीएनए के लिए Lipofectin की एक 1:1 के अनुपात बना. कमरे के तापमान पर 30-45 मिनट के लिए सेते हैं. धीरे 1.5.1 से 1.5.2 के साथ समाधान एक ड्रॉप – वार फैशन में मिश्रण (कुल = 200 μL मात्रा). 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े चलो. पुराने मध्यम विकास कोशिकाओं से निकालें और 5 मिलीलीटर F12K सीरम मुक्त मध्यम के साथ कोशिकाओं धोने और फिर F12K सीरम मुक्त मध्यम हटायें. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में, धीरे ताजा F12K माध्यम से 1.8 मिलीलीटर में एक ड्रॉप – वार फैशन में अभिकर्मक मिश्रण मिश्रण. फिर, पीबीएस के साथ 1.5 कदम कोशिकाओं से धोया और कोशिकाओं को इस नए अभिकर्मक समाधान जोड़ें. 18 घंटे के लिए सेते हैं. बदलें मध्यम के एंटीबायोटिक दवाओं के बिना माध्यम से अधिक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम F12K और रातोंरात सेते हैं. दो टी-25 बोतल F12K मध्यम प्लस एक और 18 घंटे के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (बंटवारे की कोशिकाओं के लिए कृपया देखने के कदम 1.3) के साथ में कोशिकाओं भाजित. मध्यम चयनात्मक मध्यम (F12K माध्यम से अधिक 10% 800μg/ml GENETICIN के साथ भ्रूण गोजातीय सीरम, Invitrogen) के साथ बदलें. संस्कृति कोशिकाओं 3-4 सप्ताह के लिए चयनात्मक माध्यम का उपयोग कर. समय के साथ इस कोशिकाओं है कि stably उनके जीनोमिक डीएनए में प्लाज्मिड शामिल है के लिए चुन लिए जाएँगे. रखरखाव मध्यम (F12K माध्यम से अधिक 10% 400μg/ml GENETICIN के साथ भ्रूण गोजातीय सीरम) का उपयोग कोशिकाओं को बनाए रखने जारी रखें. समय – समय पर ठंड मीडिया के 1:1 अनुपात (20% DMSO के साथ चयनात्मक माध्यम) अप्रत्याशित संदूषण के मामले में खो देता है को रोकने के साथ सेल लाइनों फ्रीज. Clonal सेल लाइनों का चयन: एक पहला कदम के रूप में trypsinize, और रखरखाव के माध्यम से 1.8 कदम से 1.3 चरण में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. पुनः निलंबित कोशिकाओं 5 मिलीलीटर रखरखाव मध्यम में ले, सेल के 0.5 मिलीलीटर को निलंबित और ताजा रखरखाव के माध्यम से 4.5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक 10x कमजोर पड़ने बनाने. एक 96 अच्छी तरह से थाली के 12 कुओं में 10x कमजोर पड़ने स्थानांतरण, प्रत्येक अच्छी तरह से 100 μl जोड़ने के लिए एकल कक्षों के लिए चयन करें. 100 μl प्रति एक सेल (सामान्य रूप से अंतिम कमजोर पड़ने -11 10 के रेंज में 10 से -19 जाएगा, 10x धारावाहिक dilutions की कुल संख्या 19 है ~) के एक सैद्धांतिक अंतिम निलंबन के लिए इन कोशिकाओं के 10x धारावाहिक dilutions बनाने के लिए जारी रखें . तत्काल प्रत्येक कमजोर पड़ने के बाद, 96 अच्छी तरह से थाली के 12 कुओं में कमजोर पड़ने के 100 μl हस्तांतरण. 18 घंटे के ऊष्मायन के बाद, एक औंधा प्रकाश या प्रतिदीप्ति खुर्दबीन और मार्क कुओं है कि केवल एक एकल कक्ष होते हैं या दो कोशिकाओं जाहिर है कि एक एकल कोशिका से विभाजित होते दिखाई देते हैं के तहत 96 अच्छी तरह प्लेटें निरीक्षण करते हैं. हर दिन और मध्यम परिवर्तन देख हर तीन दिन रखें. जब कुओं 80% conflu रहे हैंent है (एक सप्ताह के बारे में), 200 μl पीबीएस के साथ चिह्नित कुओं कुल्ला और उन्हें पीबीएस trypsin – EDTA समाधान के 100 μl के साथ trypsinize. 1 मिलीलीटर रखरखाव मध्यम के साथ एक थाली 6 अच्छी तरह अच्छी तरह से एक में अच्छी तरह से चिह्नित प्रत्येक से स्थानांतरण कोशिकाओं. 3 दिनों के लिए उन कोशिकाओं को विकसित तो व्यक्ति T25 फ्लास्क में कोशिकाओं हस्तांतरण. टेस्ट इन agonist पेप्टाइड्स (कृपया 2 अनुभाग देखें) के साथ कैल्शियम bioluminescence परख का उपयोग कोशिकाओं. 1 कैल्शियम bioluminescence थाली परख में सबसे अधिक प्रतिक्रिया के साथ 1.11 कदम से सेल लाइन का चयन करें और एक दूसरी बार एकल कक्ष चयन निम्नलिखित 1.9-1.11 कदम के लिए प्रदर्शन. समय – समय पर सेल लाइनों फ्रीज. माध्यमिक कदम 1.12 में वर्णित चयन से, कैल्शियम bioluminescence थाली परख में सबसे अधिक प्रतिक्रिया के साथ 2-3 सेल लाइनों का चयन और संस्कृति में उन्हें आगे कैल्शियम bioluminescence थाली assays के लिए बनाए रखने. बीतने संख्या का ट्रैक रखें. समय – समय पर से जल्दी मार्ग से सेल लाइनों स्थिर ताकि आप हमेशा उन्हें वापस जा सकते हैं अगर अधिक अंश के साथ सेल लाइनों लगातार प्रदर्शन रोक. 2. कैल्शियम bioluminescence थाली परख ब्याज की एक अभिव्यक्ति वेक्टर में रिपोर्टर जीन Ligate. यहाँ हम aequorin प्लाज्मिड mtAEQ/pcDNA1 (डीआरएस. सीजेपी Grimmelikhuijzen और माइकल विलियमसन, कोपेनहेगन, डेनमार्क के विश्वविद्यालय से एक उपहार) का इस्तेमाल किया. ई. में प्लाज्मिड रूपांतरण कोलाई कोशिकाओं (Invitrogen) MC1061/PS और उन्हें शुद्ध QIAprep स्पिन miniprep किट (Qiagen इंक) का उपयोग . अंतिम चरण में पानी नहीं EDTA बिना बफर Tris के साथ प्लाज्मिड elute. 1.13 कदम से सेल लाइनों के रखरखाव के माध्यम से वांछित रिसेप्टर व्यक्त आगे बढ़ें. जब कोशिकाओं को 90% मिला हुआ हैं, trypsinize, अपकेंद्रित्र और फिर 1.3 चरण में के रूप में 5 मिलीग्राम रखरखाव के माध्यम से कोशिकाओं फिर से निलंबित. पतला कोशिकाओं (रखरखाव मध्यम के साथ के बारे में 10x) और माइक्रोस्कोपी के तहत काउंटर सेल (Hemacytometer उज्ज्वल रेखा) के साथ सेल संख्या गिनती. लगभग 2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल सेल नंबर समायोजित (औसत 20 कोशिकाओं 9 चौकों की Hemacytometer में पता चला) . बीज एक छह अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 2 मिलीलीटर मीडिया में पतला कोशिकाओं. 24 घंटे (कोशिकाओं के बारे में 60% confluency ऊष्मायन के बाद तक पहुंच जाना चाहिए) के लिए सेते हैं. OPTI-सदस्य मध्यम 6 कुओं की थाली में मीडिया बदलें. प्रत्येक अच्छी तरह से 4 μl FuGENE 6 अभिकर्मक अभिकर्मक (Roche बायोकेमिकल्स) के साथ एक microfuge ट्यूब में 96 μl OPTI-सदस्य और मिश्रण 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं. प्रत्येक ट्यूब में 1 / aequorin pcDNA 1 प्लास्मिड डीएनए के μg जोड़ें और फिर धीरे से 1 मिनट के लिए नमूना हिला, 15-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. प्रत्येक अच्छी तरह से में एक dropwise फैशन में प्रत्येक मिश्रण जबकि धीरे से अच्छी तरह से थाली मिलाते जोड़ें. 6 घंटे के लिए प्लेटें सेते और मध्यम बदलने के लिए एंटीबायोटिक के बिना 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त मध्यम F12K. छह अच्छी तरह से थाली में 24 घंटे के लिए incubating कोशिकाओं के बाद, trypsinize, अपकेंद्रित्र और 1.3 कदम के रूप में कोशिकाओं का फिर से निलंबित. 2.1 कदम के रूप में चार लाख कोशिकाओं / मिलीलीटर के लिए सेल नंबर की गणना और एक 96 – अच्छी तरह से सफेद पतली नीचे microtitre थाली (३६१० costar) की प्रत्येक अच्छी तरह में 100 μl (कुल 40,000 cells/100 μl) हस्तांतरण. के बारे में 80% सेल confluency जब तक एक और 24 घंटे के लिए सेते हैं. यह bioluminescence परख के लिए कोशिकाओं के इष्टतम एकाग्रता है. एक कैल्शियम मुक्त DMEM (Invitrogen) मीडिया अंधेरे में 5 सुक्ष्ममापी coelenterazine (Invitrogen) युक्त के 90μl/well तैयार (coelenterazine संवेदनशील प्रकाश है). 2.4 से थाली ले लो, पुराने मीडिया को हटाने और प्रत्येक कुएँ में इस 90μl जोड़ने. अंधेरे में 3 घंटे के लिए 37 प्लेटें सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2, जिसके बाद थाली में कोशिकाओं का परीक्षण करने के लिए बनने के लिए तैयार हैं . 3. साधन संचालन और डेटा विश्लेषण प्रत्येक bioluminescence प्लेट पाठक अलग है. हम अपने एक NOVOstar (बीएमजी Labtechnologies) bioluminensence मोड में प्लेट रीडर का उपयोग परख करते हैं. यदि आप एक अलग उपकरण का उपयोग करते हैं, तो आप प्रोटोकॉल का अनुकूलन करना चाहिए. पर्ज उपयोग करने से पहले थाली पाठक पंप (या प्रधान पंप). थाली धारक पर थाली डालने से पहले बंद कमरे में प्रकाश मुड़ें. एक बार थाली धारक बंद कर दिया गया है, पर रोशनी की बारी है. कैल्शियम मुक्त DMEM मीडिया में पेप्टाइड्स (1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में) solubilize. "Aspirate गहराई" और उपयोग करने से पहले पेप्टाइड समाधान के "स्थिति निर्धारण" सेट. पेप्टाइड्स के अलग सांद्रता (FFFSWG – NH2, एडीज-K1-3, या अन्य वांछित पेप्टाइड) के 10 μl (10x) के साथ कोशिकाओं को चैलेंज और तुरंत प्रकाश उत्सर्जन रिकॉर्डिंग शुरू. हम अच्छी तरह से प्रत्येक 50 सेकंड कुल समय के लिए हर 2 सेकंड के लिए साधन प्रकाश उत्सर्जन (465 एनएम) रिकॉर्ड स्थापित किया है. एक सक्रिय (अनुरूप FFFSWGa इस्तेमाल किया गया है, तनेजा – बागेश्वर एट अल, 2009) एनालॉग और वेक्टर केवल ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के रूप में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें. नकारात्मक नियंत्रण डेटा विश्लेषण के दौरान आवश्यक आधारभूत सीमा निर्धारित (प्रतिनिधि परिणाम देखने).एक असंबंधित, निष्क्रिय पेप्टाइड भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में जोड़ा जा सकता है. रन के बाद पूरा हो गया है, साधन (या प्रधान पंप) पंप फिर अपने अगले पेप्टाइड नमूना जगह धो लो. अपने डेटा को बचाने और पंप फिर से धो. डाटा हैंडलिंग: प्रत्येक अच्छी तरह से एक Microsoft Excel डेटा पत्रक में प्रकाश उत्सर्जन के डेटा स्थानांतरण. GraphPad सॉफ्टवेयर इंक (सैन डिएगो, CA, संयुक्त राज्य अमेरिका) से चश्मे सॉफ्टवेयर 4.0 Excel से डेटा चिपकाएँ. विभिन्न पेप्टाइड सांद्रता X-अक्ष और bioluminescence इकाइयों Y-अक्ष है. डेटा मानक के अनुसार करने के लिए, लॉग – प्रतिक्रिया एक वक्र साजिश. प्रत्येक पेप्टाइड के लिए एकाग्रता की प्रतिक्रिया घटता प्राप्त एक nonlinear प्रतिगमन वक्र फिट विश्लेषण (चर ढलान के साथ sigmoidal समीकरण खुराक – प्रतिक्रिया) का चयन करें. कार्यक्रम के अंत में मान भूखंडों और 50 चुनाव आयोग देता है . प्रत्येक प्रयोग डेटा विश्लेषण के लिए तीन बार दोहराया जाना चाहिए. 4. प्रतिनिधि परिणाम: जब चो-K1 कोशिकाओं में व्यक्त, मच्छर एडीज aegypti kinin रिसेप्टर एक multiligand रिसेप्टर के रूप में व्यवहार और कार्यात्मक तीन endogenours एडीज kinins, Aedae kinins 1-3 के 1 एनएम के रूप में कम के रूप में में सांद्रता के जवाब अकेले कैल्शियम bioluminescence थाली परख का उपयोग कर परीक्षण किया . चित्रा 1 से पता चलता है कि शक्ति के रैंक आदेश प्राप्त Aedae> Aedae – कश्मीर-2 – कश्मीर-3> Aedae – कश्मीर-1, Aedae-K-3, 16.04 एनएम के संबंधित चुनाव आयोग 50 मूल्यों पर आधारित था, Aedae – कश्मीर 2, 26.6 एनएम और Aedae-K-1, 48.85 एनएम, जो सांख्यिकीय महत्वपूर्ण (पी <0.05) विभिन्न (Pietrantonio एट अल., 2005) थे. हम भी इस परख इस्तेमाल किया निर्धारित करने के जो kinin अवशेष kinin बातचीत पेप्टाइड रिसेप्टर के लिए महत्वपूर्ण हैं. कीट kinin पेप्टाइड्स है कि जैविक गतिविधि, भी कोर के रूप में में जाना जाता है के लिए आवश्यक न्यूनतम अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है एक सी – टर्मिनल pentapeptide साझा करें. तालिका 1 में kinin पेप्टाइड कोर analogs कोर kinin pentapeptide FFSWGa के एक Alanine प्रतिस्थापन श्रृंखला के रूप में संश्लेषित थे और कैल्शियम bioluminescence थाली परख (तनेजा – बागेश्वर एट अल., 2006) द्वारा परीक्षण किया गया. हमने पाया है कि अमीनो एसिड 1 Phe और टीआरपी 4 के दोनों रिसेप्टर्स के लिए कीट kinins की गतिविधि के लिए आवश्यक थे. परख भी बढ़ाया biostability के लिए डिजाइन पेप्टाइड्स परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तालिका 2 से पता चलता लिए डिज़ाइन kinin isobutyric (AIB) अमीनो एसिड टिकटिक रीकॉम्बीनैंट kinin रिसेप्टर और चित्रा 2 पर परीक्षण युक्त analogs छह अल्फा अमीनो isobutyric एसिड analogs की टिकटिक kinin चो-K1 सेल लाइन कैल्शियम द्वारा व्यक्त रिसेप्टर पर गतिविधि की तुलना से पता चलता है bioluminescence थाली परख (तनेजा – बागेश्वर एट अल., 2009). hexapeptide अनुरूप FFFSWGa रिसेप्टर गतिविधि के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए जोड़ा जाता है. एनालॉग एफएफ [AIB] WGA इस hexapeptide नियंत्रण अनुरूप की तुलना में अधिक सक्रिय हुई. दो aminoisobutyric एसिड प्रतिस्थापन, AIB [] एफएफ [AIB] WGA, के साथ अनुरूप डबल बदलने analogs परीक्षण (तालिका 2 और चित्रा 2) के सबसे शक्तिशाली था. कैसे इस परख रहा है और किया जा सकता है Nachman और Pietantonio (2010), Nachman एट अल देखें लागू की अधिक उदाहरण के लिए. (2009), तनेजा – बागेश्वर एट अल. (2008a), और तनेजा बागेश्वर एट अल. (2008b). चित्रा 1. एडीज का आकलन चो K1 एक थाली कैल्शियम bioluminescence परख के द्वारा E10 कोशिकाओं पर प्रभावी एकाग्रता (50 ईसी) kinins एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता में y-अक्ष bioluminescence प्रत्येक के लिए मनाया अधिक से अधिक प्रतिक्रिया का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त की इकाइयों से प्राप्त किया गया था. पेप्टाइड. डेटा बिंदुओं तीन स्वतंत्र प्रयोगों के दौरान प्राप्त छह प्रतिकृति के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं. बार्स मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं. (ए) Aedae-K1 50 ईसी का आकलन = 48 एनएम. (बी) Aedae-K2 50 ईसी का आकलन = 26 एनएम. (सी) Aedae-K3 50 ईसी का आकलन = 16 एनएम. चुनाव आयोग 50 Aedae-K3 <50 ईसी Aedae K2 <चुनाव आयोग 50 Aedae-K1, पी <0.05. सांख्यिकीय विश्लेषण और रेखांकन GraphPad चश्मे 4.0 सॉफ्टवेयर के साथ थे. चित्रा 2. छह अल्फा अमीनो टिकटिक kinin एक कैल्शियम bioluminescence थाली परख द्वारा चो-K1 सेल लाइन व्यक्त रिसेप्टर पर isobutyric एसिड analogs की गतिविधि तुलना. Y-अक्ष एक एकाग्रता में मनाया bioluminescence का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त प्रत्येक एनालॉग के लिए प्रतिशत अधिक से अधिक bioluminescence इकाइयों का प्रतिनिधित्व करता है अधिक से अधिक सभी प्रत्येक एनालॉग के लिए परीक्षण सांद्रता के बीच मनाया प्रतिक्रिया बनाम. सांख्यिकीय विश्लेषण और रेखांकन GraphPad चश्मे 4.0 सॉफ्टवेयर के साथ प्रदर्शन किया गया. रिसेप्टर सेल लाइन टिक मच्छर रिसेप्टर सेल लाइन </tr> पेप्टाइड्स चुनाव आयोग 50 (एनएम) 1 मिमी पर अधिकतमबिटरेट bioluminescence प्रतिक्रिया चुनाव आयोग 50 (एनएम) 1 मिमी पर अधिकतमबिटरेट bioluminescence प्रतिक्रिया AFSWGa मैं मैं मैं मैं FASWGa 586 +५,६०० ND 400 FFAWGa 64 12,800 621 +३,०५० FFSAGa मैं मैं मैं मैं FFSWAa 417 +१०,६०० 2800 1830 FFSWGa 590 10,800 ND 525 FSWGa मैं मैं मैं मैं FFSWa मैं मैं मैं मैं FFSWG-OH मैं मैं मैं मैं FFFSWGa 259 13,000 562 10,000 एफएफ [AIB] WGA 29 12,700 445 +९,३०० तालिका 1. अनुमानित (50 ईसी) potencies और सभी टिकटिक और मच्छर रिसेप्टर ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों पर परीक्षण पेप्टाइड्स के अधिक से अधिक bioluminescence प्रतिक्रिया *. * 50 ईसी एक आधा अधिक से अधिक प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए आवश्यक एकाग्रता का अनुमान है. मैं: निष्क्रिय अगर bioluminescence प्रतिक्रिया में कम से कम 300 यूनिट (वेक्टर केवल ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के स्तर) है. एक: स्थिति जहां पेप्टाइड FFSWGa में संबंधित अवशेषों alanine द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है. एनडी: अनुरूप परीक्षण किया गया था लेकिन या तो बहुत सक्रिय नहीं था या कम molarities में सक्रिय नहीं था, इस प्रकार एक EC50 निर्धारित नहीं किया जा सका. कश्मीर AIB-1 [AIB] एफएफ [AIB] WGA कश्मीर AIB-2 [MEF α] एफएफ [AIB] WGA कश्मीर AIB-3 एसी आर [AIB] एफएफ [AIB] WGA कश्मीर AIB-4 एसी आर [β3F] एफएफ [AIB] WGA कश्मीर AIB-5 [AIB RFF] [AIB] WGA कश्मीर AIB-6 [AIB AIB-AIB-AIB] RFF [AIB] WGA टेबल 2. Kinin analogs (कश्मीर), एमिनो isobutyric एसिड (AIB) युक्त टिकटिक रीकॉम्बीनैंट kinin रिसेप्टर पर परीक्षण किया. एसी:; एसिटाइल α मुझे: α मिथाइल-फेनिलएलनिन, β3F: β3-फेनिलएलनिन, एक: एमाइड.

Discussion

हम पहली neuropeptide Arachnida (ticks, कण, और मकड़ियों), टिक kinin रिसेप्टर से खोज रिसेप्टर के कार्यात्मक विशेषताओं का प्रदर्शन करने में सक्षम थे, इस प्रोटोकॉल का उपयोग. इस विधि के तीन प्राथमिक आवेदन किया है. सबसे पहले, इस तकनीक ligand गतिविधि के मापन के माध्यम से रिसेप्टर deorphanization के लिए लागू किया जा सकता है. दूसरा, परख ligand रिसेप्टर संरचना गतिविधि संबंध (एसएआर) को हल कर सकते हैं. तीसरा, तरीकों दवाओं की खोज में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल agonists antagonists के लगभग किसी भी GPCR पर गतिविधि का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम छोटे पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन करने के लिए शुरुआत कर रहे हैं. सेल लाइन हम का उपयोग सर्वव्यापी जी प्रोटीन ₁₆ जी व्यक्त नहीं करता है. हम इसे की जरूरत नहीं थी क्योंकि GQ प्रोटीन और intracellular कैल्शियम झरना के माध्यम से सन्धिपाद kinin रिसेप्टर्स संकेत और वे स्तनधारी कोशिकाओं में इस संकेत गुणों के संरक्षण के रूप में यहाँ दिखाया.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
CHO-K1 cells	ATCC	CCL-61	Manassas, VA, USA
F12K medium	Invitrogen	21127
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0643
Trypsin-EDTA (10x)	Invitrogen	15400
Antibiotic-Antimycotic	Invitrogen	15240
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Invitrogen	31985
Lipofectin Reagent	Invitrogen	18292-011
GENETICIN	Invitrogen	10131035
MC1061/P3 Ultracomp	Invitrogen	C663-03
QIAprep spin miniprep kit	Qiagen Inc.	19064
FuGENE 6 Transfection reagent	Roche	11 814 443 001
96-well white thin bottom microtitere plate	Costar	3610
calcium-free DMEM media	Invitrogen	21068
Coelenterazine	Invitrogen	C-2944
Bright-Line Hemacytometer	Hausser Scientific		Horsham, PA
NOVOstar	BMG Labtechnologies
Prism software 4.0	GraphPad Software Inc.		San Diego, CA, USA
T-25 and T-75 Flasks	BD Falcon	353014 and 353135