Die Messung der Aggregate Zusammenhalt durch Gewebeoberfläche Tensiometrie

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Bindungsenergie, ausdrückbar als Gewebe Oberflächenspannung zwischen den Zellen in 3D-Gewebe-like-Aggregate. Unterschiede im Gewebe Oberflächenspannung wurde gezeigt, dass mit Invasivität der Lunge, Muskel-und Hirntumoren zu korrelieren, und sind von grundlegender Bedeutung Determinanten der Gründung räumlichen Beziehungen zwischen den verschiedenen Zelltypen.

Abstract

Der objektiven Messung von interzellulären Bindungsenergie kann nur mit Methoden in thermodynamischen Prinzipien in Systemen geerdet im Gleichgewicht sein. Wir haben Gewebeoberfläche Tensiometrie (TST) entwickelt speziell auf die freie Oberflächenenergie der Interaktion zwischen Zellen zu messen. Die biophysikalischen zugrunde liegenden Konzepte TST wurden bereits im Detail ^1,2 beschrieben. Die Methode beruht auf der Beobachtung, dass beide Seiten geschlossene Zellen, wenn in Schüttelkultur gepflegt wird spontan in Cluster zusammenbauen basiert. Mit der Zeit werden diese Cluster Runde bis zu Kugeln zu bilden. Diese Aufrundung Verhalten imitiert das Verhalten charakteristisch für flüssigen Systemen. Interzelluläre Bindungsenergie wird durch Zusammendrücken sphärische Aggregate zwischen parallelen Platten in einem speziell entwickelten Gewebe Oberfläche Tensiometer gemessen. Das gleiche mathematische Gleichung benutzt, um die Oberflächenspannung einer flüssigen Tropfen messen wird verwendet, um die Oberflächenspannung von 3D-Gewebe-like kugelförmigen Aggregaten zu messen. Die zelluläre Äquivalent von Flüssigkeit Oberflächenspannung interzellulären Bindungsenergie, oder allgemeiner, Gewebe Kohäsivität. Frühere Studien aus unserem Labor haben gezeigt, dass Gewebe Oberflächenspannung (1), wie zwei Gruppen von embryonalen Zellen miteinander interagieren ^1-5, (2) können einen starken Einfluss auf die Fähigkeit von Geweben mit Biomaterialien ⁶ zusammenwirken, (3) kann prognostiziert nicht nur durch direkte Manipulation von Cadherin-basierten interzellulären Zusammenhalt ^7, sondern auch durch Manipulation der wichtigsten ECM-Moleküle wie FN ^8-11 und 4) verändert werden korreliert mit invasive Potential von Lungenkrebs ^12, Fibrosarkom ^13, Gehirntumor ¹⁴ und Prostata-Tumor Zell-Linien ^15. In diesem Artikel werden wir das Gerät beschrieben und detailliert die Schritte erforderlich, um Sphäroide zu generieren, um die Sphäroide in das Tensiometer Kammer laden, zu aggregieren Kompression zu initiieren und zu analysieren und zu validieren das Gewebe Messung der Oberflächenspannung erzeugt.

Protocol

1. Aggregate Vorbereitung für die Messung von Gewebe Oberflächenspannung. Für adhärente Zellen können Sphäroide entweder mit dem hängenden Tropfen-Methode oder durch die Erzeugung eines kohärenten Blatt von Zellen, die dann in 1 mm-Fragmente geschnitten werden können gebildet werden. Aggregatbildung durch die hängenden Tropfen-Methode: Near-konfluenten adhärenten Zellkulturen zu 90% Konfluenz sollten angebaut werden sollten, worauf Monoschichte…

Discussion

Mess-Aggregat Zusammenhalt durch TST ist relativ einfach. Es gibt jedoch wichtige Schritte, die gemeistert werden müssen, um nutzbare TST Daten vorzulegen; 1) Aggregate müssen "gesund". Dies kann durch Sicherstellung, dass Aggregatbildung mit Zellen, die bei optimaler Zusammenfluss vor Ablösung sind beginnt gesteuert werden. Aggregate Größe und Zeit in der Kultur müssen ebenfalls kontrolliert, um die Entwicklung eines nekrotischen Kern innerhalb der Aggregation zu minimieren; 2) Ein weiterer Parameter, T…

Materials

• water bath/shaker (New Brunswick Scientific, Edison, NJ)
• 10 ml round-bottom flasks (Belco, Vineland, NJ)