Протокол для сбора и окрашивания гемоциты от желтой лихорадки комаров Aedes aegypti</em
Summary
Упрощенный еще точный метод для сбора и пятна комаров гемоциты описывается. Наш метод сочетает в себе простоту перфузии с точностью высокотехнологичной техники инъекции, чтобы изолировать чистые препараты гемоциты в Aedes комаров. Этот метод облегчает исследованиях, требующих знания типов гемоцитов и их изобилие.
Abstract
Комары являются переносчиками для целого ряда болезнетворных патогенов, таких как вирус желтой лихорадки, малярии паразиты и филяриатозных червей. Лаборатории проводят расследование против патогенных компонентов иммунной системы в переносчиками болезней видов в надежде получения трансгенных комаров, которые поддаются таких патогенов 1, 2. Врожденной иммунной системы комаров состоит из нескольких линий защиты 3. Патогенные микроорганизмы, которые удается бежать барьер введенные эпителия картонных комаров кишки 4 введите гемолимфы и сталкиваются с циркулирующим гемоциты, важные клеточные компоненты, которые инкапсулируют и поглотит патогенов 5, 6. Ученые не нашли доказательств кроветворной ткани в комаров и текущие данные свидетельствуют о том, что количество гемоцитов зафиксирована на уровне взрослых возникновение и цифры могут на самом деле падение, как комар возрасте от 7. Умение правильно собрать и идентифицировать гемоциты из медицинской важных насекомых является важным шагом для исследований в клеточный иммунитет. Тем не менее, небольшой размер комаров и ограниченного объема гемолимфы создать проблему для сбора клеток иммунной системы.
Две организованные методы сбора комаров гемоциты включают изгнание из гемолимфы сократить хоботок 8, и объема перемещения (перфузии), в котором солевой вводится в мембранных necklike области между головой и грудной клетки (например, шейки матки) и перфузии гемолимфы собирается из разорванной открытия в дистальной части брюшной полости 9, 10. Эти методы, однако, ограничиваются низкой восстановления гемоцитов и возможного загрязнения жировыми клетками тела, соответственно 11. Совсем недавно метода называют высокий инъекции / восстановления обеспечивают быстрое восстановление иммуноцитов с использованием антикоагулянта буферов при одновременном снижении уровня загрязнения масштабов и внутренних тканей 11. Хотя этот метод позволяет усовершенствованный метод сбора и хранения гемоциты для первичной культуры, оно влечет за собой ряд впрыска и сбора шаги, которые не нужны, если вниз по течению целью является сбор, фиксация и пятно гемоциты для диагностики. Здесь мы демонстрируем наш метод сбора комаров гемолимфы, что сочетает в себе простоту перфузии, используя антикоагулянта буферы вместо физиологического раствора, с точностью высокотехнологичной техники инъекции, чтобы изолировать чистые препараты гемоциты в Aedes комаров.
Protocol
Discussion
Гемоцитов метод сбора описанные здесь изменяется от ранее опубликованных методов и позволяет изолировать чистую препараты гемоциты от комаров Aedes с меньшим количеством шагов. Хотя наш особый интерес заключается в характеризующие гемоцитов населения в Aedes комаров, мы считае?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Джона Фрея и Бен Петерсон для москитных воспитания. Мы также благодарим Кристин Дэвис и Гари Radice за помощь в гемоцитов микрофотографии. Это исследование было профинансировано из Университета Ричмонда искусств и наук летом стипендии А. А. Каюм и преподавателей предоставить А. Telang.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) |
Sutter Instrument | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research | MINJ-4 |
References
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
- Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
- Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
- Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
- Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
- Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
- Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).
