Un poco costoso, metodo throughput elevato per il rilevamento simultaneo di fino a 43 bersagli molecolari è descritto. Applicazioni di MPCR / RLB comprendono digitando microbica e la rilevazione di agenti patogeni multipli da campioni clinici.
Multiplex PCR / Reverse Blot test Linea ibridazione permette di rilevare fino a 43 bersagli molecolari in 43 campioni con una reazione multiplex PCR seguita da ibridazione sonda su una membrana di nylon, che è riutilizzabile. Le sonde sono 5 'amina modificato per consentire la fissazione alla membrana. Primer sono 5 'biotina modificato che permette di individuare i prodotti di PCR ibridato con streptavidina-perossidasi e di un substrato chemiluminescente tramite pellicola fotosensibile. Con l'installazione e bassi costi di consumo, questa tecnica è poco costoso (circa US $ 2 per esempio), ad alto rendimento (membrane multiple possono essere trattati contemporaneamente) e ha un breve periodo di tempo di risposta (circa 10 ore).
La tecnica può essere utilizzata in diversi modi. Sonde multiple possono essere progettati per rilevare variazione di sequenza all'interno di un singolo prodotto amplificato, o più prodotti possono essere amplificati simultaneamente, con uno (o più) sonde per il rilevamento successive. Una combinazione di entrambi gli approcci possono essere utilizzati anche all'interno di un singolo test. La possibilità di includere sonde multiple per una sequenza bersaglio unico rende il test altamente specifici.
Applicazioni pubblicate su MPCR / RLB comprendono il rilevamento di 1,2 geni di resistenza agli antibiotici, la digitazione di Staphylococcus aureus resistente alla meticillina 3-5 e Salmonella sp 6, sierotipizzazione molecolare di 7,8 Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae 9 e enterovirus 10,11, identificazione di Mycobacterium sp 12, il rilevamento di 13-15 genitale e le vie respiratorie 16 e altri 17 agenti patogeni e la rilevazione e l'identificazione delle Mollicutes 18. Tuttavia, la versatilità della tecnica significa che le applicazioni sono praticamente illimitate e non limitato ad analisi molecolare di microrganismi.
I cinque passi in MPCR / RLB sono: a) Primer e il design della sonda, b) estrazione del DNA e PCR amplificazione c) Preparazione della membrana, d), ibridazione e rilevazione, ed e) La rigenerazione della membrana.
Il MPCR / RLB metodo permette la rilevazione simultanea di un gran numero di ampliconi della PCR. A causa della elevata sensibilità della sonda chemiluminescenza a base di rilevazione, una singola reazione di PCR multiplex con un gran numero di coppie di primer può essere utilizzato per amplificare il modello del DNA.
Se nessun segnale della sonda si ottengono con uno o più campioni, eseguendo l'elettroforesi su gel con tutti i prodotti rimanenti PCR può aiutare a distinguere se il problema è con l'amplificazione PCR o ibridazione della sonda. Dove tutti i segnali della sonda sulla membrana sono deboli o assenti, ma elettroforesi su gel indica successo PCR, le possibilità sono problemi con l'etichettatura della membrana, la rigenerazione non corretta della membrana dopo l'uso precedente, le temperature non corretto durante l'incubazione ibridazione o streptavidina, o difettoso streptavidina- perossidasi coniugato o reagenti di rilevamento.
Se i campioni di controllo indicano che le sonde individuo può essere la produzione di falsi segnali negativi, PCR singola con gel a base di rilevazione e sequenziamento successive possono essere eseguite per verificare l'amplificazione del prodotto PCR e per cercare variazione di sequenza nel sito di legame della sonda. Segnale della sonda debole o assente può essere dovuto alla dimensione amplicone di grandi dimensioni: se possibile, tutti ampliconi devono essere di lunghezza simile e meno di 300 bp. Le strutture secondarie del DNA di ampliconi può anche produrre vincolante poveri sonda, e potrebbe essere necessario ri-progettazione di primer. Primer o concentrazioni sonda può anche essere variata per ottimizzare la potenza del segnale.
Falsi segnali positivi grazie alla sonda di legame del primer nonamplified o primer-dimero prodotto può essere indagato eseguendo singole PCR con gel a base di rilevazione e la sequenza successiva. In questo caso, riprogettazione delle sonde possono risultare necessarie. Mutazioni puntiformi nei siti di legame della sonda può portare a segnali deboli o assenti. Permettere due sonde per ogni prodotto amplificato rende questo facile da individuare. Questa caratteristica può essere sfruttata con primer e attenta progettazione della sonda per rilevare piccole variazioni di sequenza del DNA bersaglio.
In sintesi, mentre ci sono molti metodi di prodotto reazioni PCR multiplex dopo la rilevazione disponibile, MPCR / RLB ha il vantaggio di essere high-throughput e poco costoso, con bassi costi di setup. La flessibilità del metodo ne consenta l'uso in una vasta gamma di applicazioni.
The authors have nothing to disclose.
Matteo O'Sullivan e Fei Zhou sono destinatari di Australian National Health and Medical Research Council Borse di studio post-laurea la ricerca medica.
Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
5′ amine C6 modified oligonucleotide probes | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S-8875 | 0.5 M solution made up to pH 8.4 |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | 0.1M solution |
20xSSPE buffer | Amresco | 0810-4L | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L-4390 | Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) | Sigma-Aldrich | E7750 | Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water |
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20×20 cm | PALL life sciences | 74480C | |
Deionised, purified water | |||
Liquid Pyroneg detergent | Johnson Diversey | HH12291 | |
Streptavidin-peroxidase conjugate | Roche | 11 089 153 001 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
Amersham ECL detection reagents | GE Healthcare | RPN2105 | |
OHP Transparency film | Corporate Express | EXP 504 OHP | |
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18×24 cm | GE Healthcare | 28906837 | |
Ice |
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh | Thermo Scientific | HBSNSRS220 | Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use |
The Belly Dancer rocking platform | Stovall life science | Euro BDbo | |
Miniblotter | Immunetics | MN100-45 | |
Water bath | |||
Suction | |||
Hot plate | |||
Exposure cartridge | Sigma-Aldrich | Z36,009-0 | |
X-ray film developer | Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film |
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.