Vibratome Sectioning voor Enhanced Behoud van de Cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti
Summary
Een eenvoudige procedure van vibratome snijden het orgaan van Corti, gevolgd door immunohistochemie en confocale microscopie is beschreven. Deze procedure zorgt voor een betere conservering van de fijne cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti, en dus zorgt voor accurate kwantificering van celtypen.
Abstract
De zoogdieren orgaan van Corti is een sterk geordende cellulaire mozaïek van mechanosensorische haar en nonsensory ondersteunende cellen
(Beoordeeld in 1,2). Visualisatie van dit cellulair mozaïek vereist vaak dat het orgaan van Corti is cross-delig. In het bijzonder kan de nonsensory pijler en Deiters 'cellen, waarvan de kernen zijn basaal gelegen met betrekking tot de haarcellen, niet zichtbaar worden zonder cross-opdeling het orgaan van Corti. Echter, de delicate cytoarchitecture van de zoogdieren orgaan van Corti, met inbegrip van de fijne cytoplasmatische processen van de pijler en Deiters 'cellen, is moeilijk te behouden door routine histologische procedures, zoals paraffine en cryo-snijden, die compatibel zijn met standaard immunohistochemische kleuring technieken.
Hier beschrijf ik een eenvoudige en deugdelijke procedure die bestaat uit vibratome opdeling van het slakkenhuis, immunohistochemische kleuring van deze vibratome secties in hele berg, gevolgd door confocale microscopie. Deze procedure is op grote schaal gebruikt voor immunhistochemical analyse van veelvoudige organen, waaronder de muis ledematen knop, zebravis darmen, lever, pancreas en hart (zie 3-6 voor geselecteerde voorbeelden). Daarnaast is deze procedure was succesvol voor zowel beeld-als quantitificaton van de zuil aantal cellen in de mutant en controle organen van Corti in zowel embryo's en volwassen muizen 7. Deze methode is echter momenteel niet op grote schaal gebruikt om de zoogdieren orgaan van Corti te onderzoeken. Het potentieel voor deze procedure tot een betere bescherming bieden beide van de boete cytoarchitecture van de volwassen orgaan van Corti en zorgen voor kwantificering van de verschillende celtypen wordt beschreven.
Protocol
Discussion
De procedure van vibratome snijden, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming zorgt voor de visualisatie van het orgaan van Corti met minimale weefselbeschadiging. Het is duidelijk, confocale beelden genomen van de interne regio's in de vibratome hoofdstuk tonen uitstekende conservering van cellulaire morfologie, dat wordt alleen beperkt door fixatie artefacten. Confocale beelden dichtbij genomen om de twee cut-oppervlakken van een vibratome sectie zijn vaak niet te onderscheiden van afbeeldingen van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteur wil graag gebruik maken van de Children's Research Institute Imaging Core voor de confocale microscopie en Dr Jian Zhang voor de suggestie erkennen om delen met behulp van agarose parels monteren. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie DC010387.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Zeiss | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
References
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision. Dev Cell. 15, 738-748 (2008).
- Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development. Nature. 418, 501-508 (2002).
- Trinh, L. A., Stainier, D. Y. Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish. Dev Cell. 6, 371-382 (2004).
- Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish. Dev Cell. 18, 973-984 (2010).
- Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling. Dev Cell. 8, 553-564 (2005).
