متساوي الكالوري المعايرة لقياس جزيء ضخم - يجند الانجذاب
Summary
ويرد بروتوكول عام لاستخدام قياس الكالوري المعايرة متحاور لرصد ملزمة للديناميكا الحرارية مع النظم البيولوجية الانتماءات الملزمة معتدلة.
Abstract
متساوي الكالوري المعايرة (ITC) هو أداة مفيدة لفهم الصورة الكاملة للالحرارية رد فعل ملزم. في العلوم البيولوجية ، وتفاعلات الجزيئات أساسية في فهم آلية عمل الخلايا. ويمكن تكييف الظروف التجريبية ، مثل العازلة ودرجة الحرارة ، ونظام الربط سيما التي تجري دراستها. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تخطيط دقيق منذ يجند معينة ويتراوح تركيز جزيء ضرورية للحصول على بيانات مفيدة. تركيزات من جزيء ويجند حاجة إلى أن تحدد بدقة لنتائج موثوقة. الرعاية يحتاج أيضا إلى أن تؤخذ عند إعداد العينات والشوائب يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على التجربة. ويتم الحصول على عندما أجرى تجارب مركز التجارة الدولية ، جنبا إلى جنب مع الضوابط ، وبشكل صحيح ، والمعلومات المفيدة ملزمة ، مثل تقارب ، رياضيات الكيمياء والمحتوى الحراري. عن طريق تشغيل مزيد من التجارب المختلفة أو العازلة تحت ظروف درجات الحرارة ، ويمكن الحصول على معلومات أكثر تفصيلا حول هذا النظام. ويرد بروتوكول لإعداد الأساسية للتجربة مركز التجارة الدولية.
Protocol
متساوي الكالوري المعايرة (ITC) هي تقنية راسخة يمكن تحديد كافة المعلمات الحرارية (تقارب ، والمحتوى الحراري رياضيات الكيمياء) من تفاعل ملزمة في تجربة واحدة. 1 المركز يعمل من خلال المعايرة one المتفاعلة في المتفاعلة الثاني تحت ظروف متساوي. إشارة قياس الحرارة هو الإفراج عنهم أو استيعابها على التفاعل (ملزمة) من المواد المتفاعلة اثنين. يتم تنفيذ سلسلة من الحقن ، وإشارة الحرارة سوف نهج الصفر كما المتفاعلة يصبح الحد المشبعة. تركيب الأيسوثرم تعطي المعلمات الحرارية. تتوفر العديد من الاستعراضات التي تصف الأجهزة وكذلك الرياضيات لجمع البيانات وتحليلها. 2،3 سعرات حرارية بينما الأخرى المتوفرة (وأبرزها المركز 200 مع حجم صغير) ، ونحن هنا وصف بروتوكول العامة لمركز التجارة الدولية VP – تصنيعها بواسطة MicroCal (وهي الآن جزء من شركة جنرال الكتريك للرعاية الصحية). 1. إعداد العينات من أجل إعداد جزيء ويجند في العازلة ، بعض المشاكل المحتملة تحتاج الى معالجة. يناسب دقيقة تتطلب تركيز السليم للجزيء ، والأنواع التي تذهب عادة في الخلية عينة من مركز التجارة الدولية ، ويجند ، والأنواع في المحقنة الحقن. لأن بعض البروتينات الكلية في التركيزات العالية الضرورية لهذه الأنواع في حقن حقنة ، يتم تحميل معظم الأحيان من البروتين في الخلية العينة. يتم تحديد التركيز الأمثل جزيء من "ج" ، والمنتج للتقارب المتوقعة للنظام ، والتي يمكن تقديرها باستخدام الطرق المتعامدة قبل لاستخدام مركز التجارة الدولية ، وتركيز مجموع جزيء ، حيث ج = ك أ * [م]. القيم المثلى لمجموعة من ج 1 ، 1-10 على الرغم من أنه من الممكن الحصول على بيانات دقيقة عن ضعف الأنظمة الملزمة في ظل ظروف تجريبية محددة مع ج قيم أقل من الحد الأدنى. 4 وهكذا ، لا بد من تحديد جزيء مع تركيز هذه المجموعة من ج القيم في الاعتبار (أي عن K (أ) من M 6 10 -1 ، وينبغي استخدام تركيزات جزيء من 1-10 ميكرون). يمكن معرفة مسبقة للتقارب ملزمة للنظام مساعدة على تقليل بروتين يستخدم للمركز من خلال تصميم أفضل من تجربة مركز التجارة الدولية. وينبغي تركيز يجند تكون كبيرة بما يكفي (7-25 أضعاف أكثر تركيزا من د K لموقع أضعف يجند ملزم) بحيث تشبع يحدث في الثلث الأول من نصف المعايرة. تركيب دقيقة من البيانات يتطلب أيضا للإشارة التشبع. لأنظمة أعلى مع تقارب ملزمة ، ينبغي استخدام تركيز أقل يجند لتجنب التشبع في وقت مبكر جدا في المعايرة ، والتي سوف تعطي يناسب دقيقة. بمجرد طرح الحرارة التخفيف من سيطرة (المعايرة أي من يجند في المخزن) من المعايرة ، يجب أن المحتوى الحراري في التشبع النهج صفر. لأن الشوائب جزيء صغير يمكن أن تؤدي إلى إشارات مصطنعة في القياسات مركز التجارة الدولية ، فمن الأفضل ، إذا أمكن ، أن تكون شاملة لمدال جزيء ويجند ضد العازلة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام اللوني العمود ، تحلية أعمدة الدوران ، أو عازلة مرشحات تبادل الطرد المركزي (على سبيل المثال ، Centricons) لتغيير العازلة للجزيء. إذا كان يجند هو جزيء صغير يمكن إعداده باستخدام العازلة غسيل الكلى بعد مدال على جزيء أو عن طريق الأغشية dialyzing ضد غسيل الكلى مع انقطاع مناسبة للجزيئات صغيرة (أي 100-500 دا لسبكترا / بور تعويم – A – Lyzer ). يمكن أن الاختلافات في تكوين عازلة بين يجند وحلول تؤدي إلى جزيء إشارة التحف من حرارة التخفيف من الشوائب في العينات. بعد التحضير ، تحقق للتأكد من درجة الحموضة في المباراة الفاصلة ، ويجند جزيء (درجة الحموضة وحدات ± 0.05) والقطع الأثرية في المحتوى الحراري يمكن أن تنشأ نتيجة لآثار العازلة protonation 5 تأكد من أن يعد ما يكفي من كل الأنواع. ثلاث نسخ للتجارب والتحكم التخفيف ، فإن كمية المواد المطلوبة يتوقف على المركز المستخدمة. ولكن بالنسبة لمعظم الصكوك التي لديها مركز التجارة الدولية تقريبي حجم العينة 2 مل الخلايا ، سوف تكون هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 6-7 مل من محلول جزيء ، ويمكن أن تكون مستعدة بشكل ملائم في 15 مل أنابيب الصقر. الحقن الحقن لمدة 300 ميكرولتر ، ينبغي 1-2 مل من محلول تكون كافية ، ويمكن أن تكون على استعداد في أنابيب أو مواسير الصقر microcentrifuge. يمكن الغبار والجسيمات الأخرى ، والسبب التحف في الأساس من مخطط حراري مركز التجارة الدولية. لا بد من أن تكون إزالتها قبل إلى تشغيل التجربة. بعد تحضير عينة من الحلول الأسهم ، يجب طرد هذه العينات في أنابيب microcentrifuge لمدة خمس دقائق في 8000 إلى 14،000 دورة في الدقيقة للجسيمات بيليه في الحل. إزالة طاف ، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه ، ووضعها في أنبوب الصقر / microcentrifuge جديدة. إذا كانت هناك حاجة للحفاظ على الاختزال cysteines خفض استخدام تركيزات منخفضة ومخزونات جديدة من مركا – βptoethanol ، TCEP (تريس (2 – الكربوكسيل) الفوسفين) أو dithiothreitol للحد من أي التحف بسبب أكسدة اختزال. أيضا ، لا يمكن وجود المذيبات العضوية في المخزن (مشتركة لبعض يغاندس جزيء صغير التي قد تحتاج إلى الميثانول أو DMSO لكي تكون قابلة للذوبان) قد يسبب التحف الإشارة. إذا كانت هناك حاجة المذيبات العضوية ليجند ، ثم يجب حل جزيء يحتوي أيضا على نفس التركيز على تجنب أي إشارة الناجمة عن الحرارة التخفيف من المذيبات العضوية. اختلافات طفيفة في تركيبة عازلة بين جزيء ويجند بسبب cosolvents ، وأملاح أو الحموضة من الممكن أثناء إعداد العينات. فمن الأفضل للتحقق من التخفيف من يجند في المخزن المؤقت عينة أو نموذج العازلة في جزيء للتأكد من أن اشارات الحرارة الناجمة عن الاختلافات في المحتوى المخزن لا تسبب البيانات التي تنشأ فقط من التحف. الاختيار لتركيزات جزيء ويجند بعناية باستخدام التقنيات المناسبة لنظامك (مثل قياسات الامتصاصية ، HPLC ، المقايسات اللونية ، BCA المقايسات للبروتينات ، الخ) لتسجيل تركيزاتها بالضبط. والاختلافات في التركيز الفعلي والتركيز المستخدم لتناسب الأيسوثرم تسبب أخطاء في رياضيات الكيمياء ، والمحتوى الحراري تقارب ملزمة تحدد من هذه التجربة. ومن الشائع لديغا العينات لتجنب الآثار إشارة بسبب فقاعات الهواء أو إطلاق الغازات الذائبة خلال المعايرة ، وخاصة عند ارتفاع درجات الحرارة. 2. إعداد تجربة تأكد من تنظيف الخلية عينة الحقن والمحاقن وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة قبل تحميل جزيء ويجند. شطف الخلية عينة مرتين أو ثلاث مرات مع 1.8 مل من الماء المقطر باستخدام محقنة هاميلتون (استخدام الرعاية مع حقنة هاملتون كما هو كسر بسهولة للبرميل أو عازمة إبرة). شطف المقبل الخلية عينة عدة مرات مع 1.8 مل من العازلة. تحميل خلية العينة مع 1.8 مل من محلول جزيء ، والحرص على تجنب تشكيل الفقاعة. ملء الخلية المرجعية بالماء المقطر. بالنسبة لمعظم المخازن ، والماء المقطر على ما يرام لاستخدام كحل المرجعية. ومع ذلك ، لمخازن مع القوة الأيونية عالية بشكل خاص أو الأسمولية ، فمن الأفضل استخدام العازلة كمرجع. إزالة فقاعات الهواء من الخلايا المرجعية والعينة باستخدام الحقنة هاملتون. تحرك بلطف إبرة المحقنة تصل إلى أسفل وعلى جانبي الخلية يطرق أي فقاعات التي قد تكون في الجزء السفلي من الخلية وتعلق على البئر إلى أعلى الخلية. إزالة أي وحدة تخزين الزائدة من العينة والخلايا المرجعية. نعلق حقنة بلاستيكية لملء المنفذ للحقن حقنة باستخدام الأنابيب. شطف حقنة الحقن بالماء المقطر. متابعة من قبل العازلة الشطف. تأكد من اجلاء تماما حقن حقنة عن طريق رسم الهواء من خلال النظام. وضع إبرة الحقنة الحقن في حل يجند واستخلاص الحل يجند في حقن حقنة حقنة حتى بأكمله ممتلئ. تواصل رسم حجم الفائض قليلا (ما يقرب من 50 ميكروليتر أو أكثر) في الميناء وأنابيب المرفقة. فورا بإغلاق المنفذ ملء من المحاقن وفصل أنابيب المحقنة والبلاستيك. تطهير وإعادة ملء الحقنة الحقن مرتين أكثر لإزالة أي فقاعات من الحقنة. إزالة المحقنة من الحل يجند وامسح جنب مع kimwipe لإزالة أي قطرات ، والحرص على عدم لمس رأس المحقنة إلى kimwipe لأن هذا قد يزيل من حجم الحقنة. أيضا ، يجب الحرص على عدم ضرب جرة أو الحقنة لأن هذا أيضا يمكن أن يسبب خسارة في حجم من طرف الحقنة. مكان الحقنة الحقن في الخلية العينة. إعداد معلمات لتشغيل المركز. لأنظمة الربط مع إشارات قوية الحرارة ، فإن عددا كبيرا من الحقن انخفاض حجم إعطاء المزيد من البيانات عن نقاط المناسب (على سبيل المثال 75 حقنة من 3 ميكرولتر). عن الأنظمة التي لديها إشارات الحرارة ضعيفة ، وعدد قليل من حقن كمية كبيرة هي الأفضل (مثل حقن 8 33 ميكرولتر). الأكثر شيوعا ، يتم استخدام عدد أقل من الحقن مع وحدات التخزين العالي الحقن. قد يستغرق عدة المعايرة لتحسين الظروف التي هي الأفضل للنظام الخاص بك. ومن المهم أن نشير إلى أن المحتوى الحراري ملزم يمكن أن تكون إما طاردة للحرارة أو ماصة ، تبعا للنظام التي تجري دراستها. للأسف ، بعض الأنظمة والإشارات حرارة منخفضة ، مما يجعل حرارة رد فعل من الصعب تحديد. يمكن أن يحتمل مشاكل مع هذه النظم يمكن التغلب عليها عن طريق زيادة تركيز جزيء ، وتغيير درجة حرارة التجربة (وهذا يتوقف على قدرة الحرارة للنظام ملزم) ، و / أو تعديل درجة الحموضة أو قوة الأيونية للالعازلة. تنظر أيضا في التباعد الزمني بين كل حقنة. فمن المحتم أنه بعد كل حقنة من يجند ، يعطى نظام الوقت لكي تتوازن وإشارة الحرارة يعود إلى الأساس قبل الحقن يحدث المقبل. بالنسبة لمعظم النظم ، 3-5 ميلوينبغي أن تكون كافية nutes. وينبغي زيادة الوقت بين لأنظمة الحقن حيث موازنة لا تحدث في غضون خمس دقائق. لأنه سيكون هناك بعض الخلط بين جزيء والحلول يجند في حقن حقنة مرة واحدة يتم إدراجها في الخلية العينة ، والحقنة الأولى تعطي نتائج زائفة. فمن الأفضل استخدام كميات صغيرة (مثل 2 ميكرولتر) للحقن واحد أو اثنين الأول (بحيث يمكن في وقت لاحق يتم تجاهل) والحفاظ على حقن لاحقة على القيم المطلوبة. اختيار درجة حرارة التجربة (مع 25 درجة مئوية هي الأكثر شيوعا ، على الرغم من درجات الحرارة ما بين 2 و 80 درجة مئوية يمكن استخدامها). فمن الأفضل لاختيار درجة الحرارة التي تتوافق مع تجارب أخرى (ملزمة ، حركية ، الخ) التي تجرى على نظام يجند – جزيء. يمكن تعيين ما يصل إلى المركز يوازن عند درجة حرارة مختلفة عن درجة حرارة التجربة. إذا كانت التجربة سوف يتم تنفيذ عند درجة حرارة تزيد على 10 درجة مئوية بعيدا عن درجة حرارة الغرفة ، فمن الأفضل لضبط درجة الحرارة موازنة للصك في غضون 5 درجة مئوية من الحرارة التجريبية. وهذا الانخفاض في الوقت الذي الصك سيستغرق للوصول إلى درجة حرارة التجربة. سرعة التحريك من الحقنة يحتاج أيضا إلى النظر فيها. التحريك هو ضروري لخلط الكافي ليجند وجزيء خلال المعايرة ، ولكن بعض البروتينات التي زعزعت استقرار التحريك السريع. لهذه الحالات ، يجب تعيين سرعة التحريك بمعدل منخفض نسبيا. بمجرد أن يتم تعيين كافة المعلمات التجريبية أعلى ، ثم يمكن بدء التجربة. بمجرد أن انتهت التجربة ، يمكن تنظيف المركز وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. يمكن أن تظل الحل في الخلية عينة في نهاية التجربة إذا المطلوب مزيد من التجارب على خليط معقد جزيء – يجند. تكرار المعايرة واحد على الأقل أو مرتين أكثر للحصول على بيانات استنساخه. تشغيل حيث يتم التحكم في معاير يجند العازلة في الخلية عينة لتحديد حرارة التخفيف ليجند. ويمكن لبعض النظم التي يوجد فيها التعاونية ملزمة ، على معلومات إضافية حول عملية الربط يمكن اكتسابها عن طريق حقن في جزيء يجند. ويمكن حقن توجهات مختلفة إعطاء معلومات إضافية ، والتي قد تكون مفيدة لتركب العالمية. 6 3. تحليل البيانات ويمكن تركيب البيانات يؤديها بسهولة باستخدام وحدات الماكرو في أي برنامج البيانات المناسب (الموردة من قبل الشركة المصنعة عادة جنبا إلى جنب مع وثيقة). تحميل ملف البيانات أولا. التحقق من مخطط حراري الخام عن أي دلائل على فقاعات الهواء أو التحف الأخرى في إشارة. إذا كان هناك أي التحف (مثل المسامير في الأساس أو قمم عندما لم يكن هناك في تلك النقطة حقن الوقت) ، ثم لاحظ هذه النقاط البيانات كما ينبغي إزالتها. المقبل ، وتحميل البيانات السيطرة يجند التخفيف ، وطرح البيانات يجند التخفيف من الأيسوثرم ملزمة. في هذا الوقت ، وإزالة كافة نقاط البيانات الزائفة ، بما في ذلك نقاط بيانات لأول مرة واحد أو اثنين من المعايرة حيث تحدث تخفيف الآثار (راجع الخطوة 7). حدد نموذج البيانات المناسب (موقع واحد ملزم ، وهما / مواقع الربط المتعددة ، ملزمة التعاوني ، الخ) ليتم استخدامها لاحتواء البيانات. يمكن أن يكون لائقا البيانات مع التخمينات الأولية من المعلمات المناسب ، رياضيات الكيمياء (ن) ، المحتوى الحراري (ΔH) وتقارب ملزم (K أ). إذا كان من المعروف المعرفة المسبقة للتقارب ملزمة ، أو غيرها من المعالم ، متعامد من التجارب ، ومن ثم يمكن إدخال هذه القيم. هذا يساعد على تجنب تناسب تصبح المحاصرين في الدنيا المحلية خلال المناسب. بمجرد أن يتم احتواء البيانات لمعايرة الأولى ، كرر الخطوات 15 و 16 لبقية الأيسوثرم. بدلا من ذلك ، يمكن أن يكون لائقا على الصعيد العالمي البيانات باستخدام برامج مثل SEDPHAT 6 SEDPHAT قد تكون مفيدة خاصة في تركيب قواعد البيانات العالمية المعقدة ثنائي (أي جزيئات A + B) في تركيبة ثلاثية مع مجموعات البيانات المعقدة (جزيئات A + B + C). على سبيل المثال ، في ربط جزيء C إلى مجمع AB ، فإنه ليس من الواضح دائما ما إذا كانت هناك أي إشارة قد تكون نتيجة لربط C إلى A أو B إلى A (إذا لم يتم مشبعة تماما). لضمان أن البيانات ليست مصطنعة مركز التجارة الدولية ، ينبغي مقارنة تقارب ملزمة ويتم الحصول عليها من المركز stoichiometries مع أسلوب المتعامدة. 7،8 بالإضافة إلى ذلك ، يمكن مقارنة قيمة المحتوى الحراري مركز التجارة الدولية إلى المحتوى الحراري من مؤامرة فانت هوف 9 يمكن أن يثبت أيضا أن من المفيد استخدام تركيزات مختلفة من يجند أو جزيء كقيمة مطلقة للإشارة أن تزيد الحرارة مع زيادة تركيز جزيء. القطع الأثرية التي يرجح أن تنشأ إذا لم يتم مطابقة للمخازن في الخلية والمحاقن. إمكانية أخرى لعينات من التحف تنشأ نجس. من المستحسن أن تبدأ مع المستخدم المعايرة بسيطة معقدة ثنائي الذي هناك معلومات سابقة متوفرة على د K وstoichiometry. ثم ، إذا ربط يغاندس إضافية ، يمكن للمستخدم أكثر تعقيدا محاولة المعايرة معقدة ثلاثية ، والذي يجند تركيزات متفاوتة ، وربما التحول المحقنة ومكونات الخلية. وينبغي أن يكون المحتوى الحراري للمقارنة بين كل من مسارات معقدة لتشكيل ثلاثي المضافة كما أن المحتوى الحراري هي وظيفة الدولة. 10 مرة أخرى ، SEDPHAT 6 من المرجح أن تكون مفيدة للغاية هنا. 4. ممثل النتائج : الشكل 1. مثال ممثل المعايرة حسن تصرف لالملزم للNADPH العامل المساعد لE. القولونية dihydrofolate اختزال الصبغيات (ecDHFR). لوحة (أ) يبين مخطط حراري الخام ، (B) ، وأيسوثرم ملزم من احتواء مخطط حراري متكامل باستخدام نموذج واحد في موقع البرنامج المنشأ ، و (C) في نوبة من الأيسوثرم باستخدام نموذج واحد ملزم من موقع على طول SEDPHAT مع بقايا مناسبا. من البرمجيات الأصلية ، وذلك باستخدام نموذج موقع واحد ملزم ، ن = 1.09 ± 0.02 ، K د = 0.194 ± 0.001 ميكرون ، ΔH = -22.7 ± 0.4 كيلو كالوري / مول ، TΔS = -13.1 ± 0.4 كيلو كالوري / مول ، وΔG = — 9.16 ± 0.01 كيلو كالوري / مول. نوبات من البيانات باستخدام Sedphat تحمل أعباء وجود ن 0.94 ± 0.01 ، وهو من 0،195 د ك ± 0.013 ΔM ، وهو ΔH من -22.5 ± 0.2 كيلو كالوري / مول ، TΔS من -13.39 كيلو كالوري / مول وΔG من -9.15 كيلو كالوري / مول.
Discussion
وقد استخدم على نطاق واسع في دراسة مركز التجارة الدولية التفاعلات جزيء يجند ، 11 مع دراسات تبحث في يجند من البروتين ، 12 يجند الحمض النووي RNA – 13 و 14 جزيء الدراسات. يمكن حتى يمكن تشغيل المركز مع المواد الصلبة ، مثل النانوية ، التي تشكل معلقات موحد 15 وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام أنظمة الثلاثي ، حيث يرتبط بالفعل واحدة يجند للجزيء ومعاير ليجند الثانية ، لتحديد من الديناميكا الحرارية ، ل سبيل المثال ، يمكن ربط الركيزة لنظام انزيم العامل المساعد. 7 الدراسات أيضا أن يؤديها لجزيئات مع الانتماءات الملزمة عالية جدا من شأنها أن تتجاوز عادة الحد من الكشف عن مركز التجارة الدولية عن طريق إجراء فحوصات المنافسة ملزم مع يغاندس اضعف ملزمة (16). معلومات عن الربط ضعيف ويمكن أيضا أن يحصل عليها يغاندس المقايسات المنافسة (17). ويمكن استكشاف دور المياه في الربط عن طريق مركز التجارة الدولية ، جنبا إلى جنب مع 18 من الاعتماد على إعادة تنظيم المحتوى الحراري المذيبات (19). مؤخرا ، تم قياس التغيير متعلق بتكوين الديناميكا الحرارية من المتغيرات على DNAK الملزمة وسوف ADP ATP. يمكن دراسة 20 البروتين البروتين جمعية مركز التجارة الدولية ، مما أسفر عن معلومات حول المجمعات مغاير 21 فضلا عن الجمعيات ، وطي. آثار درجة الحرارة 22 على السخانة ملزمة تعطي السعة الحرارية للحدث ملزم. (2) عدد من البروتونات استيعابها أو الإفراج عنهم بناء على ملزمة ويمكن أيضا أن تحدد من التجارب التي أجريت في مخازن مختلفة من المحتوى الحراري للتأين 5 إذا أجريت دراسات إضافية في المركز قيم الحموضة المختلفة ، حينها يمكن للالباكاف الحمضية لمجموعة متورطة تحدد (23).
لتلخيص ، وقياسات دقيقة للتركيز على جزيء ويجند أمر لا بد منه لإجراء تجربة مركز التجارة الدولية الجيدة. تركيزات عينة أيضا بحاجة إلى أن تكون ضمن النطاق المناسب للحصول على بيانات موثوقة. وينبغي توخي الحذر مع العازلة كشوائب جزيء صغير وعدم التطابق سوف يسبب الحموضة التحف في مخطط حراري.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق منح NSF MCB – 0817827.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-282 |
| 15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B |
| 2.5 mL Hamilton syringe | MicroCal | SYN161714 |
References
- Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).
- Jelesarov, I., Bosshard, H. R. Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition. J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).
- Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S. A., Freire, E. Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry. Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).
- Fukada, H., Takahashi, K. Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride. Proteins. 33, 159-166 (1998).
- Houtman, J. C. Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling. Protein Sci. 16, 30-42 (2007).
- Bradrick, T. D., Beechem, J. M., Howell, E. E. Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein. Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).
- Shenoy, S. R. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).
- Chopra, S., Lynch, R., Kim, S. H., Jackson, M., Howell, E. E. Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis. Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).
- Norris, A. L., Serpersu, E. Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System. Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).
- Falconer, R. J., Penkova, A., Jelesarov, I., Collins, B. M. Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry. J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).
- Buurma, N. J., Haq, I. Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions. Methods. 42, 162-172 (2007).
- Salim, N. N., Feig, A. L. Isothermal titration calorimetry of RNA. Methods. 47, 198-205 (2009).
- De, M., You, C. C., Srivastava, S., Rotello, V. M. Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study. J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).
- Velazquez Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era…? Priceless. Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).
- Harries, D., Rau, D. C., Parsegian, V. A. Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane. J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).
- Chervenak, M. C., Toone, E. J. A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding. J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).
- Taneva, S. G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., Muga, A. Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states. Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).
- Jelesarov, I., Bosshard, H. R. Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface. Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).
- Burrows, S. D. Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration. Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).
- Baker, B. M., Murphy, K. P. Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry. Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).
Tags
Isothermal Titration CalorimetryITCMacromolecule-ligand AffinityBinding ReactionThermodynamic PictureBiological SciencesMacromolecular InteractionsExperimental ConditionsBufferTemperatureLigand ConcentrationMacromolecule ConcentrationAccurate DeterminationSample PreparationImpuritiesITC Experiment ControlsStoichiometryAffinityEnthalpyAdditional ExperimentsBuffer ConditionsTemperature ConditionsProtocol
Cite This Article
Duff, Jr., M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity. J. Vis. Exp. (55), e2796, doi:10.3791/2796 (2011).