アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ
Summary
テロメラーゼの触媒サブユニットを分離するための努力、TERTは、構造的な研究のための十分な量で、10年以上の限られた成果しかされています。ここで、我々は組換えコクヌストモドキTERT（単離するための方法を提示<em> TC</em> TERT）とアクティブの再構成<em> T. castaneum</em>テロメラーゼリボ核タンパク質（RNP）複合体<em> in vitroで</em>。
Abstract
テロメラーゼの触媒サブユニットを分離するための努力、TERTは、構造的な研究のための十分な量で、10年以上の限られた成果しかされています。ここで、我々は組換えコクヌストモドキTERT（Tcは TERT）の単離とアクティブなTの再構成のための方法を提示in vitroでcastaneumのテロメラーゼリボ核タンパク質（RNP）複合体。
テロメラーゼは、エンドツーエンドの融合や劣化から守るために役立つ線形染色体2の3'末端にテロメアと呼ばれる短いDNAの繰り返しを、追加する特殊な逆転写酵素1です。 DNA複製の後、短いセグメントは3番染色体の端にとテロメラーゼなしで失われ、細胞は最終的に彼らのヘイフリック制限を4に達するまで分割し続けます。さらに、テロメラーゼは、成人のほとんどの体細胞5に休止状態ですが、がん細胞では細胞の不死7を促進する6アクティブになります。
酵素とTERTがテロメア8,9を合成するために使用するテンプレートが含まれている不可欠なRNA成分（TER）の触媒サブユニットを含むタンパク質のサブユニット（TERT）、：最小限のテロメラーゼの酵素は、2つのコアコンポーネントで構成されています。前の2008年まで、個々のテロメラーゼのドメイン用の唯一の構造は10,11を解決していた。この分野で大きなブレークスルーは、アクティブな12の結晶構造の決定、T.の触媒サブユニットから来たcastaneumのテロメラーゼ、Tcは TERT 1。
ここで、我々は、構造的および生化学的研究のためのアクティブな、水溶性のTcの TERT、およびテロメラーゼ活性のアッセイのためのin vitroでのテロメラーゼRNP複合体の再構成を大量に製造する方法を提示する。使用した実験方法の概要を図1に示されています。
Protocol
Discussion
ここで紹介する方法はT.の触媒サブユニットの大量の製造を可能にする構造的および生化学的研究のための水溶性、アクティブなフォームでcastaneumのテロメラーゼTERT。 Tcは TERTの過剰発現の方法は、上記のものから、温度や細胞密度の微妙な変化に敏感で、飛躍的にタンパク質の発現レベルに影響を与える可能性があります。具体的には、光学密度が600nmで0.5に到達する前…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ここで紹介する研究は、健康のペンシルバニア部、エリソン医学、Vとエメラルドの基礎によってサポートされていました。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
| 2YT Broth | Teknova | Y0215 |
| IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
| MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
| ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
| Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
| POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
| POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
| Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |
References
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. 43, 405-413 (1985).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345, 458-460 (1990).
- Hayflick, L. The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Blackburn, E. H. Telomeres: no end in sight. Cell. 77, 621-623 (1994).
- Kim, N. W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266, 2011-2015 (1994).
- Bodnar, A. G. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science. 279, 349-352 (1998).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. 51, 887-898 (1987).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. 337, 331-337 (1989).
- Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase. Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).
- Rouda, S., Skordalakes, E. Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding. Structure. 15, 1403-1412 (2007).
- Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA. Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).
