הכרומטין immunoprecipitation מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal
Summary
אנו מציגים שיטה immunoprecipitation הכרומטין מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal. גישה זו יכולה לשמש לזיהוי ספציפי גורם שעתוק אתרי הקישור ושינוי epigenetic של היסטון חשובים ו-DNA של התחדשות של אקסונים נפגע במערכת העצבים ההיקפית שני מרכזי.
Abstract
האקסונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) לא להתחדש בעוד אלה במערכת העצבים ההיקפית (PNS) לעשות להתחדש במידה מוגבלת לאחר פציעה (טנג et al. 2006). הוא זיהה כי תוכניות תעתיק חיוני תולדה neurite ו axonal הם מחדש על פגיעה ב PNS (Makwana et al. 2005). אולם הכלים העומדים לרשותו כדי לנתח ויסות הגנים עצביים in vivo מוגבלים ומאתגר לעיתים קרובות.
הגרעינים השורש הגבי (DRG) מציעים מערכת מעולה מודל פציעה כי הן CNS ו PNS מעוצבבים על ידי האקסון מפוצלת שמקורם סומה זהה. הגרעינים מייצגים אוסף של גופים נפרדים התא שבו כל האירועים תעתיק להתרחש, ובכך לספק אזור מוגדר של פעילות תעתיק כי ניתן להסיר בקלות reproducibly מן החיה. פגיעה של סיבי עצב ב PNS (למשל עצב השת), שבו התחדשות axonal קורה, צריך לחשוף סדרה של תוכניות תעתיק כי נבדלים אלה להגיב פציעה דומה למערכת העצבים המרכזית, שם התחדשות אינו מתקיים (למשל חוט השדרה ). אתרים עבור גורם שעתוק מחייבים, היסטון ושינוי ה-DNA כתוצאה מפגיעה או CNS או PNS ניתן לאפיין באמצעות הכרומטין immunoprecipitation (שבב).
כאן אנו מתארים פרוטוקול CHIP באמצעות רקמות קבוע DRG עכבר בעקבות פציעה axonal. זה שילוב רב עוצמה מספק אמצעי לאפיון הסביבה בעד התחדשות הכרומטין הכרחי לקידום התחדשות axonal.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה לשאול ישירות על הסביבה הכרומטין במהלך רגנרציה axonal במערכת העצבים הבוגרת בעקבות פציעה axonal. היא משלבת את המודל פציעה DRG עם immunoprecipitation הכרומטין לחקור את הסביבה ואת תעתיק epigenetic לאחר פציעה או CNS או PNS. זה שימושי במיוחד עבור החוקרים מי רוצה לאפיין אתרי ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות אנדריאה טדסקי לעזרה בקביעת הניסויים CHIP הראשונית של מעבדה Ricco לינדנר על תרומתו לכוונן את התנאים שבב. עבודה זו נתמכה על ידי קרן Hertie; גרנט פורצ'ן, אוניברסיטת Tuebingen, ואת DI DFG מענקים 1497/1-1 (כמובן מאליו כל סימון די ג'ובאני).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
| Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
| Glycogen | Sigma | G1767 |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Equipment needed |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
References
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
