Immuno-fluorescens-analys av Leptospiral Surface-exponerade Proteiner
Summary
En effektiv metod för att bedöma ytaktiva exponering leptospiral proteiner beskrivs. Metoden är särskilt utformade för att undvika störningar av den bräckliga yttre membranet av leptospiral celler. Denna teknik kräver anställning av flera negativa kontroller för att bedöma integriteten av yttre membran och specificitet antikroppsreaktion.
Abstract
Bakteriella ytproteiner är involverade i direkt kontakt med värdceller och upptag av näringsämnen från omgivningen 1. Av denna anledning kan cellulär lokalisering ge insikter i funktionella rollen för bakteriella proteiner. Yta lokalisering av bakteriella proteiner är ett viktigt steg mot identifiering av virulensfaktorer inblandade i mekanismer för patogenitet.
Metoder för fraktionering leptospiral membran 2-05 maj vara selektiv för en viss klass av yttre membranproteiner (OMPs), såsom lipoproteiner vs OMPs transmembrana, och därmed leda till felaktig klassificering. Detta sannolikt beror på strukturella skillnader och hur de är knutna till det yttre membranet. Lipoproteiner är associerade med membran via en hydrofob interaktion mellan de N-terminala lipid fraktion (tre fettsyror) och lipider fosfolipider tvåskiktsmembran 6, 7. Däremot är transmembrana OMPs typiskt integrerat i membranet genom amphipathic β-ark ordnade i ett fat-liknande struktur 8, 9. Dessutom har förekomsten av ett protein i yttre membranet inte nödvändigtvis garanterar att det protein eller dess domäner exponeras på ytan. Spirochetal yttre membran är kända för att vara bräcklig och därför kräver metoder som innebär varsam manipulation av celler och integrering av underjordiska protein kontroller för att bedöma integriteten av yttre membran.
Här presenterar vi ett immunofluorescenstest (IFA) för att direkt bedöma exponeringsyta av proteiner på intakt leptospira. Denna metod är baserad på erkännande av leptospiral ytproteiner av antigen-specifika antikroppar. Häri finns antikroppar specifika för OmpL54 10 detetcted aftero bindning till infödda, yta exponerad epitoper. Jämförelse av antikroppar reaktivitet på intakt kontra permeabilized celler möjliggör utvärdering av cellulära distributionen och om huruvida ett protein selektivt finns på leptospiral yta. Integriteten för yttre membran bör bedömas med hjälp av antikroppar mot en eller flera markytan proteiner, företrädesvis är belägen i periplasm.
Ytan IFA Metoden kan användas för att analysera exponeringsyta någon leptospiral protein vilka specifika antikroppar är tillgängliga. Både nyttan och begränsning av metod beror på om de använda antikroppar kan binda till infödda epitoper. Eftersom antikroppar ofta riktats mot rekombinanta proteiner, epitoper av infödda, yt-exponerade proteiner kan inte identifieras. Ändå är ytan IFA-metoden ett värdefullt verktyg för att studera delar av intakt bakteriella ytor. Denna metod kan tillämpas inte bara för leptospira utan också andra spiroketer och gramnegativa bakterier. För starkare slutsatser om yt-exponering OMPs, är en övergripande strategi som omfattar flera metoder cell lokalisering rekommenderade 10.
Protocol
Discussion
Vår yta IFA Tekniken liknar den som används för att visa på ytan exponering av olika borrelial 15, 16 och leptospiral 12, 17 proteiner. Detaljerna i ytan IFA-metoden som beskrivs här är utformade för att minimera manipulation av celler i ett försök att upprätthålla yttre membran integritet samtidigt dra nytta av tendens Leptospira celler att hålla sig till objektglas. Metoden innebär en lägre koncentration (2% respektive 4%) av paraformaldehyd, tvätt med ytter-membranstabiliserande b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie fick stöd av Public Health Service bevilja AI-34.431 (till DAH) från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar samt VA Medical Research fonder (till DAH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Difco | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen/Molecular Probes | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen/Molecular Probes | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. a. n. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G., Benz, R. . The structures of general porins. , (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
