Leptospiral 표면 노출 단백질의 단백질 형광 분석
Summary
leptospiral 단백질의 표면 노출을 평가하기위한 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 특별히 leptospiral 세포의 연약한 바깥 막의 중단을 방지하도록 설계되었습니다. 이 기술은 몇 가지 부정적인 컨트롤의 고용은 바깥 막과 항체 반응의 특이성의 무결성을 평가해야합니다.
Abstract
박테리아 표면 단백질은 호스트 세포와 직접 접촉과 환경 1 영양분의 이해에 관여하고 있습니다. 이러한 이유로, 세포 지방화는 박테리아 단백질의 기능 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 세균성 단백질의 표면 지방화는 pathogenicity의 메커니즘에 관련된 독성 요소의 식별 향한 중요한 단계입니다.
leptospiral 세포막의 2-5 fractionating위한 방법은 lipoproteins 대 transmembrane의 OMPs으로 바깥쪽 – 막 단백질 (OMPs)의 특정 클래스에 대한 선택 수 있으며, 따라서 misclassification 발생할 수 있습니다. 이 가능성은 구조적 차이가 어떻게 그들이 바깥 막으로 연결되어 있기 때문입니다. Lipoproteins은 N – 터미널 지질 잔기 (세명 지방산)과 지질 이중층의 phospholipids 6, 7 사이의 소수성 상호 작용을 통해 세포막과 연결되어 있습니다. 반면, transmembrane의 OMPs 일반적으로 배럴과 같은 구조 8, 9 배열 β – 시트 amphipathic에 의해 지질 이중층에 통합되어 있습니다. 또한, 바깥쪽 – 막의 단백질의 존재는 반드시 단백질 또는 도메인이 표면에 노출되는 것을 보장하지 않습니다. Spirochetal 외부 점막이 하위 표면 단백질의 세포와 포함의 부드러운 조작과 관련된 할거 그러므로 연약과 방법 것으로 알려져하는 것은 바깥 막의 무결성을 평가하기 위해 제어합니다.
여기, 우리는 직접적으로 손상 leptospires에 단백질의 표면 노출을 평가하기 위해 immunofluorescence 분석 (IFA) 메소드를 제시한다. 이 방법은 항원에 특정한 항체에 의해 leptospiral 표면 단백질의 인식을 기반으로합니다. 여기에, OmpL54 10 특정 항체는 기본, 표면 노출 epitopes에 aftero 바인딩 detetcted 있습니다. 손상 대 permeabilized 세포에 항체 반응의 비교는 단백질 leptospiral 표면에 선택적으로 존재 여부 세포 배포 평가를 가능하게합니다. 외부 막의 무결성이 선호 periplasm에있는 하나 이상의 표면 하의 단백질에 항체를 사용하여 평가해야합니다.
표면 IFA 방법은 특정 항체가 사용할 수있는 어떤 leptospiral 단백질의 표면 노출을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 방법의 유용 성과 한계는 모두 사용된 항체가 기본 epitopes에 바인딩할 수 있는지 여부에 따라 달라집니다. 항체가 자주 재조합 단백질, 기본, 표면 노출 단백질의 epitopes에 대한 사육되기 때문에 인정되지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 표면 IFA 방법은 그대로 세균 표면의 구성 요소를 공부를위한 유용한 도구입니다. 이 방법은 leptospires뿐만 아니라 다른 spirochetes 및 그람 음성 세균에 대해뿐만 아니라 적용할 수 있습니다. OMPs의 표면 노출에 대한 강한 결론에 대한 여러 셀 로컬 라이제이션 방법을 포함한 종합적인 접근 방식은 10 권장합니다.
Protocol
Discussion
우리의 표면 IFA 기술은 다양한 borrelial 15, 16 leptospiral 12, 17 단백질의 표면 노출을 증명하기 위해 사용하는 것과 비슷합니다. 표면 IFA 방법의 내용은 유리 슬라이드에 충실하기 위해 Leptospira 세포의 경향을 활용하면서 외부 멤브레인 무결성을 유지하기 위해 세포의 조작을 최소화하기 위해 설계되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. 이 메서드는 이전에 다음 ID로 출판 프로토?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 보건 서비스 교부금에 의해 지원되었다 AI – 34431 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서와 VA 메디컬 연구 기금 (DAH로)로 (DAH)을.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Difco | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen/Molecular Probes | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen/Molecular Probes | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop 40 |
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