Yüzey maruz Leptospiral Proteinler immuno-floresans Testi
Summary
Leptospiral proteinlerin yüzey pozlama değerlendirmek için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem özellikle kırılgan leptospiral hücrelerin dış membran kesintileri önlemek için tasarlanmıştır. Bu teknik, dış membran ve antikor reaksiyonu özgüllüğü bütünlüğünü değerlendirmek için birkaç negatif kontroller istihdam gerektirir.
Abstract
Bakteriyel yüzey proteinleri, konak hücreleri ile doğrudan temas halinde ve 1 çevre besin alımını ilgilidirler . Bu nedenle, hücresel yerleşimi bakteriyel proteinlerin fonksiyonel bir rol içgörüler sağlayabilir. Bakteri proteinleri Yüzey yerelleştirme patojenite mekanizmaları içinde yer virülans faktörleri belirlenmesi yolunda önemli bir adım.
Leptospiral membranlar 2-5 fraksiyonasyon Yöntemleri lipoproteinler transmembran OMPs vs gibi dış membran proteinleri (OMPs), belirli bir sınıf için seçici olması ve bu nedenle ması yol açabilir . Bu büyük olasılıkla yapısal farklılıklar ve dış membran ile ilişkili nedeniyle. Lipoproteinler, N-terminal lipid benzer parçaları (üç yağ asitleri) ve lipid bilayeri fosfolipit 6, 7 arasında bir hidrofobik etkileşim yoluyla membran ile ilişkilidir . Buna karşılık, transmembran OMPs genellikle β-yaprak amphipathic beşik gibi yapı 8, 9 düzenlenen çift katlı lipid içine entegre edilmiştir. Buna ek olarak, dış membran protein varlığı, protein ya da kendi etki alanı yüzeyinde maruz kaldığı garanti değildir. Spirochetal dış membranlar, alt yüzey proteini hücre ve içerme nazik manipülasyon içeren kırılgan ve bu nedenle gerektiren yöntemler olarak bilinen dış membran bütünlüğünü değerlendirmek için kontrol eder.
Burada, doğrudan sağlam leptospires proteinlerin yüzey maruziyeti değerlendirmek için immünofloresan assay (IFA) yöntemi mevcut. Bu yöntem, antijen-spesifik antikorların leptospiral yüzey proteinleri tanıma dayanır. Burada, 10 OmpL54 için spesifik antikorların yerli, yüzey maruz epitoplar aftero bağlayıcı detetcted. Sağlam karşı permeabilize hücrelerin antikor reaktivitesi karşılaştırılması bir protein seçici leptospiral yüzeyinde mevcut olup olmadığını ya da hücresel dağılımı değerlendirilmesini sağlar. Dış membran bütünlüğünü tercihen periplasm bulunan bir veya daha fazla yeraltı protein, antikor kullanarak bir şekilde değerlendirilmelidir.
Yüzey IFA yöntemi spesifik antikorların mevcuttur leptospiral protein yüzey maruz analiz etmek için kullanılabilir. Yöntemin kullanışlılığı ve sınırlama istihdam antikorlar yerli epitoplar bağlamak mümkün olup olmadığını bağlıdır. Rekombinant proteinler, yerli, yüzey maruz proteinlerin epitoplar karşı antikorları sıklıkla gündeme olduğundan kabul edilmeyecektir. Bununla birlikte, yüzey IFA yöntemi sağlam bakteriyel yüzeyler bileşenleri çalışmak için değerli bir araçtır. Bu yöntem sadece leptospires değil, aynı zamanda diğer spiroket ve gram-negatif bakteriler için değil uygulanabilir. OMPs yüzey pozlama ile ilgili güçlü sonuçlar için, birçok hücre lokalizasyon yöntemleri içeren geniş kapsamlı bir yaklaşım 10 tavsiye edilir .
Protocol
Discussion
Bizim yüzey IFA tekniği çeşitli borrelial 15, 16 ve leptospiral 12, 17 proteinler yüzeye maruz göstermek için kullanılan benzer. Burada anlatılan yüzey IFA yöntemi cam slaytlara uygun Leptospira hücrelerinin eğilim yararlanarak dış membran bütünlüğünü korumak için bir çaba hücrelerin manipülasyonu en aza indirmek için tasarlanmış. Bu yöntem, dış membran stabilize tamponu (PBS 5 mM MgCl 2) ve daha az yıkama adımları ile yıkanarak paraformaldehid pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada, Halk Sağlığı Servisi hibe tarafından desteklenen AI-34431 Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve VA Tıp Araştırma Fonu (DAH) (DAH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Difco | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen/Molecular Probes | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen/Molecular Probes | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. a. n. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G., Benz, R. . The structures of general porins. , (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
