利用定量PCR，我们展示了如何使用成熟的鸡胚尿囊膜模型对人肿瘤细胞向远端器官的转移进行定量分析。
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摘要
摘要
在转移过程中，癌细胞从原发性肿瘤扩散，侵入周围组织，并传播到远端器官。转移是一个复杂的过程，可能涉及多种组织类型，持续时间各异，且常发生在器官内部深处，因此难以研究和定量分析。此外，转移级联反应中的多个步骤都会影响转移过程的效率，使得评估肿瘤细胞行为的某一个特定方面的贡献变得困难。因此，通常需要在实验动物中进行转移实验，以提供一个必要的、真实的研究背景来观察转移过程。然而，这些模型因其复杂的生理环境而进一步增加了研究难度。鸡胚是一种独特的 in vivo 模型，由于其绒毛尿囊膜（CAM）易于操作，克服了诸多研究转移的限制。绒毛尿囊膜是位于蛋壳下方的一种富含血管的胚外组织，能够接受肿瘤细胞的异种移植（图1）。此外，由于鸡胚天然免疫缺陷，CAM能够 readily支持正常组织和肿瘤组织的移植。最重要的是，禽类CAM能够有效支持大多数癌细胞的特性，包括生长、侵袭、血管生成以及微环境的重塑。这使得该模型在研究导致癌症转移的分子通路以及预测转移性癌症对新型潜在治疗药物的反应方面具有极高的应用价值。通过物种特异性的Alu PCR检测播散的细胞，可以对仅含有低至25个细胞的定植器官进行定量评估转移情况。利用人表皮样癌细胞系（HEp3），我们使用该模型分析癌细胞向远端器官（包括鸡胚肝脏和肺）的自发性转移。此外，通过Alu-PCR方案，我们展示了该检测方法在分析和定量评估转移过程各个独立环节（如内渗、滞留、外渗和定植）方面的高灵敏度和可重复性。
方案
1. 准备受体卵用于异种移植（自发性转移）
- 将新鲜受精的鸡卵置于旋转孵卵器中，在100°F和60%湿度条件下孵育10天。每小时翻转卵4次。
- 发育第10天，将卵横向放置于卵架上。使用鹅颈灯或其他合适的光源，通过将光线照射到卵的钝端（气室所在位置）进行照卵。
- 定位并标记绒毛尿囊膜静脉。该静脉位于卵壳顶部，是多条大血管的交汇处。在此分支点，血管向下延伸，离开绒毛尿囊膜并连接至胚胎。用铅笔在卵壳上距离该分支点约1 cm处绘制一个1 cm的正方形。随后使用浸有碘液的棉签清洁该正方形及其周围区域。
- 使用配备碳化硅磨石（Dremel 零件号 #84922）的旋转切割工具，在卵的钝端钻孔穿透至气室。使用同一工具在卵顶部先前绘制的正方形区域内钻孔，但停止在卵壳膜之前。使用末端带有细小钻头的25号针头在卵壳膜上穿刺一个小孔，注意避免撕裂下方的绒毛尿囊膜。随后，通过将一段¼” Tygon管连接至自动移液器辅助装置，并将其紧贴气室上的孔，利用轻柔的负压将正方形区域内的绒毛尿囊膜从卵壳膜上分离。施加负压后，正方形孔下方应出现一个气腔，表明绒毛尿囊膜已成功脱离卵壳。绒毛尿囊膜脱落后，使用实验室胶带封闭气室上的孔以及靠近绒毛尿囊膜静脉的正方形区域上的孔。随后将卵转移至静止孵卵器中，在100°F和60%湿度条件下继续孵育，以准备后续肿瘤细胞移植。顺序操作示意图见图1。
2. 准备用于静脉注射的卵（实验性转移）
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讨论
数十年来，鸡胚尿囊膜（CAM）一直被用作研究癌症生物学和转移进展多个方面的模型系统。多个研究团队已利用该模型对转移能力进行了基本评估，包括对休眠状态（Aguirre Ghiso et al., 1999; Ossowski 和 Reich, 1983）、组织重塑（Deryugina et al., 2005; Hahn-Dantona et al., 1999）以及转移过程（Zijlstra et al., 2008; Zijlstra et al., 2002）的分析。由于其操作简便、可接受异种移植以及成本低廉，该模型在癌症生物学研究中持续具有很强的吸引力（Chambers et al., 1982; Chambers et al., 1990）。通过使用针对人类特异性Alu序列的定量PCR技术（Kim et al., 1998; Zijlstra et al., 2002），我们展示了分析人鳞状细胞癌HEp3细胞系转移播散能力的方法（图3）。此外，我们还展示了该技术在评估治.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢泰森食品公司（Tyson Foods Inc.）慷慨提供受精卵。Shanna Arnold 在本实验方案的拍摄过程中发挥了重要作用。 Trenis Palmer 获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）鲁思·L·柯什斯坦国家研究服务奖（Ruth L. Kirschstein National Research Service Award）下的F31国家癌症研究所奖（F31 National Cancer Institute）资助。本研究部分得到了CCSRI基金（项目号：700537）对JDL的资助，以及美国国立卫生研究院/国家癌症研究所（NIH/NCI）基金（项目号：CA120711-01A1 和 CA120711-01A1）对AZ的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1X 达尔伯克’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基） | Invitrogen | 11995073 | |
| 杜尔贝科’D-磷酸盐缓冲液（1X），液体 | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| 含EDTA 4Na的0.05%（1X）胰蛋白酶溶液 | Invitrogen | 25300054 | |
| 运动员孵化器 | Berry Hill | 1550HA | 这些培养箱是最容易获得的设备之一。然而，视频中将展示不同的仪器。 |
| 运动型培养箱 | 贝里山 | 1502EA | 这些培养箱是最容易获得的设备之一。然而，视频中将展示不同的仪器。 |
| Dremel 旋转工具 | Dremel | ||
| Dremel 切割片，编号 36 | Dremel | 409 | |
| 便携式移液器辅助器 | Fisher Scientific | 1368115E | |
| 棉签 | Fisher Scientific | 23-400-001) | |
| 受精卵 | 各种 | 可使用多个不同供应商。鸡蛋重量应在约35-55克之间。产蛋母鸡的年龄应介于36至55周龄之间。 | |
| 血细胞计数板 | 豪泽科学 | 15170-090 | |
| 光纤显微镜照明器 | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25号针头 | |||
| Sybr Green 提取物—N-Amp 组织 PCR 试剂盒 | Sigma-Aldrich | XNATRG |
参考文献
- Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V.
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重印与许可
