ई. के रोग विशेषताओं में से एक Amyloid β प्रोटीन सकारात्मक neuritic सजीले टुकड़े के गठन है. Immunohistochemical एबीसी और थपका विधि और फ्लोरोसेंट का पता लगाने का पता लगाने का उपयोग कर एस thioflavin धुंधला विधि का उपयोग: इस प्रोटोकॉल में हम के लिए ट्रांसजेनिक ई. मॉडल चूहों में neuritic सजीले टुकड़े का पता लगाने के लिए दो विधियों का वर्णन करती है.
अल्जाइमर रोग (ई.) सबसे आम neurodegenerative विकार मनोभ्रंश के लिए अग्रणी है. Neuritic पट्टिका गठन एक अल्जाइमर रोग के रोग पहचान की है. neuritic सजीले टुकड़े के केंद्रीय घटक है एक छोटे filamentous नामक प्रोटीन amyloid β प्रोटीन (Aβ) 1, जो बीटा amyloid प्रोटीन अग्रदूत β-secretase और γ-secretase द्वारा (एपीपी) के अनुक्रमिक proteolytic दरार से व्युत्पन्न है. amyloid परिकल्पना जरूरत पर जोर देता है कि ई. विकृति में 2 अंतर्निहित विषाक्त तंत्र के रूप में सजीले टुकड़े Aγ युक्त . neuritic पट्टिका की उपस्थिति के शवपरीक्षा विश्लेषण ई. के निदान की पुष्टि करता है. ई. रोगजनन में Aγ तंत्रिका जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को आगे करने के लिए, विभिन्न माउस उपभेदों ई. से संबंधित मानव एपीपी जीन में म्यूटेशन व्यक्त उत्पन्न किया गया. रोग की गंभीरता पर निर्भर करता है, इन चूहों को अलग – अलग उम्र में neuritic सजीले टुकड़े का विकास होगा. इन चूहों रोगजनन और नशीली दवाओं के विकास कि एपीपी प्रसंस्करण मार्ग और neuritic पट्टिका गठन को प्रभावित कर सकता है के अध्ययन के लिए अमूल्य उपकरण के रूप में सेवा करते हैं. इस प्रोटोकॉल में, हम ई. मॉडल चूहों में neuritic सजीले टुकड़े के विशिष्ट पता लगाने के लिए एक immunohistochemical विधि रोजगार. Immunohistochemical एबीसी और थपका विधि और फ्लोरोसेंट का पता लगाने का उपयोग कर एस thiofalvin धुंधला विधि का उपयोग कर पता लगाने: हम विशेष रूप से आधा दिमाग, paraformaldehyde निर्धारण, cryosectioning, और दो ई. ट्रांसजेनिक चूहों में विक्षिप्त सजीले टुकड़े का पता लगाने के तरीकों निकालने से तैयारी पर चर्चा करेंगे.
लेबल biotinylated 4G8 एंटीबॉडी दाग ई. में neuritic सजीले टुकड़े का उपयोग immunohistochemistry विशिष्टता के साथ चूहों मॉडलिंग की. धुंधला परिणाम विभिन्न उपचार समूहों के बीच पट्टिका लोड की मात्रा का ठहराव और तुलना की अनुमति देता है. वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम है कि परिणाम को प्रभावित कर सकता हैं. क्योंकि HEMI दिमाग खोपड़ी से निकासी के लिए पहले perfused नहीं कर रहे हैं, देखभाल निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए क्रम में HEMI मस्तिष्क को नुकसान को रोकने. इसके अलावा, के बाद से HEMI मस्तिष्क निष्क्रिय perfused है, हम यह पीएफए में 4% 4 में कम से कम 48 घंटे के लिए incubating की सिफारिश डिग्री सेल्सियस से पहले 30% sucrose के समाधान में submerging. वैकल्पिक रूप से, transcardial छिड़काव मस्तिष्क निकालने के लिए पहले किया जा सकता है. यदि मस्तिष्क ठीक से तय हो गई है, यह एक रबड़ बनावट होना चाहिए. मामले में जहां मस्तिष्क ठीक से तय नहीं है, अनुभागों को आसानी से डी 'Olomos समाधान में या धुंधला हो जाना प्रक्रिया के दौरान आंसू जाएगा.
4G8 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एमिनो एसिड 17-24 Aβ के अवशेषों को प्रतिक्रियाशील है और कोर अनुक्रम (VFFAE) में मिलान को मान्यता दी. चूंकि 4G8 माउस प्रजातियों से प्राप्त होती है, यह एक उच्च पृष्ठभूमि धुंधला दे जाता है. इस प्रकार, हम विचार एक सच्चे संकेत प्राप्त करने के लिए, जबकि पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना कम से कम के साथ संकेत कमजोर पड़ने पर वर्गों सेते चुना.
Neuritic सजीले टुकड़े 4G8 एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाने के लिए immunostaining के अलावा, एक एस thioflavin धुंधला विधि भी सजीले टुकड़े की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है. Thioflavin एस एक समरूप डाई मिश्रण है dehydrothiotoluidine के sulfonic एसिड के साथ मेथिलिकरण से परिणाम है कि. Thioflavin एस गैर चुनिंदा प्रोटीन का बीटा शीट amyloid oligomers में उन के रूप में, सामग्री बांध. बंधन पर, thioflavin अपने उत्सर्जन स्पेक्ट्रम की एक विशेषता नीले बदलाव आए. इसके विपरीत एस thioflavin monomeric रूपों के लिए बाध्य एक नीले बदलाव नहीं बटोर और फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के साथ पता चला नहीं सकता. एस Thioflavin धुंधला amyloid के लिए स्क्रीन के लिए एक त्वरित विकल्प प्रदान करता है के रूप में प्रतिदीप्ति की तीव्रता amyloid जमा की छोटी मात्रा के अच्छा दृश्य की अनुमति देता है. हालांकि, एस thioflavin धुंधला के बारे में एक दोष विशिष्टता की कमी है. कई युक्त fibrinoids, Hyaline, केरातिन, आदि जैसे व्यापक बीटा शीट, सहित अन्य ऊतक घटकों, इस डाई के लिए एक नहीं बल्कि आकर्षण है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा (CIHR), टाउनसेंड परिवार, और जैक ब्राउन और परिवार अल्जाइमर रिसर्च फाउंडेशन (करने के लिए किया गया था) द्वारा समर्थित किया गया. अल्जाइमर रोग में कनाडा अनुसंधान चेयर की धारक है. PTTL प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसल और स्वास्थ्य अनुसंधान छात्रवृत्ति के लिए माइकल स्मिथ फाउंडेशन द्वारा समर्थित है.
Name of the reagent and equipment | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
Polyvinylpyrrolidene | Sigma-Aldrich | PVP40-100G |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 |
Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558-2L |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
88% formic acid | Fisher Scientific | A118P-500 |
Triton X-100 | ICN Biomedicals | 807426 |
H2O2 | Sigma-Aldrich | H-1009 |
Biotin Labeled 4G8 Antibody | Cedarlane | SIG-39240-500 |
Elite ABC kit | Vector | PK-6100 |
Imm PACT DAB | Vector | SK-4105 |
Xylene | Fisher Scientific | X4-4 |
Entellan | EM science | 65037-71 |
Superfrost* Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Cryostat | Leica | CM-3050-S |
MX35 Premier microtome blade | Thermo Scientific | 3052835 |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892-25G |