Neurotropic माउस हेपेटाइटिस वायरस से संक्रमित चूहों की रीढ़ की हड्डी डोरियों में माउस तंत्रिका स्टेम सेल के प्रत्यारोपण शल्य चिकित्सा

Summary

माउस स्थापित demyelination के साथ चूहों की रीढ़ की हड्डी डोरियों में तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) का प्रत्यारोपण विस्तृत है. एनएससी की तैयारी, वक्ष 9 कशेरुका (T9), और एनएससी के प्रत्यारोपण के laminectomy के साथ चूहों के पूर्व और पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल के साथ उल्लिखित है.

Abstract

माउस हेपेटाइटिस वायरस के neurotropic JHM तनाव (MHV) से संक्रमित चूहे रोग और नैदानिक ​​demyelinating रोग मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) के साथ रोगियों के समान परिणामों को विकसित करना. हम दोनों remyelination और नैदानिक ​​परिणाम में एक महत्वपूर्ण सुधार में बीमार चूहों परिणामों के स्पाइनल तार में एनएससी की है कि प्रत्यारोपण से पता चला है. पुरानी neurologic रोगों के उपचार के लिए सेल प्रतिस्थापन उपचार अब एक वास्तविकता है और vivo मॉडल में engrafted कोशिकाओं और मेजबान ऊतक microenvironment के बीच बातचीत को समझने में महत्वपूर्ण हैं. इस प्रस्तुति JHMV संक्रमित चूहों की रीढ़ की हड्डी में कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए एक अनुकूलित विधि प्रदान करता है. संक्षेप में, हम मैं के लिए एक प्रक्रिया प्रदान करते हैं) एनएससी की तैयारी प्रत्यारोपण करने से पहले, ii) चूहों के पूर्व ऑपरेटिव देखभाल, iii) laminectomy के माध्यम से रीढ़ की हड्डी के जोखिम, iv) एनएससी के stereotactic इंजेक्शन, और iv) पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल .

Protocol

1. तैयार Xylazine ketamine समाधान (Ketamine एक नियंत्रित पदार्थ विस्तृत रिकॉर्ड और रखा जाना चाहिए समाधान एक सुरक्षित, बंद स्थान में संग्रहीत है.) तैयार है. स्वच्छ और बाँझ उपकरण. सड़न रोकनेवाला एजेंट के साथ पोंछते और फिर बाँझ कागज ताड़ना के साथ कवर के द्वारा शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में तैयार, और micromanipulator सेट. 2. प्रत्यारोपण के लिए कक्ष की तैयारी कक्ष 100,000 सेलों / ई एल के एक एकाग्रता के लिए resuspended होना चाहिए और, हालांकि केवल 250.000 कोशिकाओं माउस प्रति प्रतिरोपित कर रहे हैं, कक्षों की एक अतिरिक्त सिरिंज लोड हो रहा है प्रयोजनों (माउस प्रति कम से कम 300.000 कोशिकाओं कोशिकाओं प्राप्त तैयार) के लिए आवश्यक है. HBSS में 3 बार एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार शीशी में प्रत्यारोपित किया जा कोशिकाओं धो लें. अंतिम स्पिन पहले कोशिकाओं की गणना. बाद अंतिम स्पिन नीचे, छानना HBSS और उल्टा में स्थिति गोली पहुंचने से बूंदों को रोकने के नीचे शीशी छोड़. एक यूवी विकिरणित, बाँझ Kimwipe के साथ सूखी अंदर की दीवारों. गोली सूखे की अनुमति नहीं है. ट्यूब ईमानदार होल्डिंग, धीरे धीरे और बहुत नाजुक HBSS के आधे अंतिम वांछित मात्रा में कोशिकाओं resuspend. एक विंदुक टिप में निलंबन के बहुमत pipetting और फिर pipetter पर डायल समायोजन जब तक पूरे निलंबन विंदुक टिप में कुल मात्रा उपाय. यह आपको बता कितना अधिक HBSS वांछित एकाग्रता के लिए की जरूरत है. HBSS जोड़कर वांछित राशि के लिए मात्रा लाओ. बर्फ पर वापस प्लेस. कक्षों की व्यवहार्यता की जाँच करें अगर वे बर्फ पर अब से 2 घंटे के लिए किया जाना चाहिए. 3. सर्जरी और प्रत्यारोपण के लिए चूहों की तैयारी (100mg/kg) ketamine और ~ 100 μl खुराक में xylazine (10mg/kg) या समकक्ष संवेदनाहारी के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize. शल्य प्रस्तुत करने से suturing पूरी प्रक्रिया 30-40 मिनट लग जाएगा. (वैकल्पिक: प्रत्येक माउस की पूंछ संख्या, रंग टेप लागू करने के लिए पहचान सुनिश्चित) कम गर्दन को पीछे से माउस के पृष्ठीय क्षेत्र दाढ़ी, और 2 midline से द्विपक्षीय सेमी बिजली कतरनी के साथ, विस्तार. बाल संभव के रूप में बंद के रूप में कटौती की जानी चाहिए (यह क्षेत्र पर कई बार जाना आवश्यक हो सकता है). शेष बाल निकालने के लिए, एक धुंध के साथ बालों को हटाने क्रीम (नायर) की एक पतली परत लागू applicator इत्तला दे दी. 1-2 मिनट के बाद, साबुन पानी के साथ हल्के गीला धुंध के साथ बंद नायर पोछ लो. तैयार क्षेत्र को साफ नंगे त्वचा के बिना बाल के किसी भी आवारा टुकड़े है कि बाद में शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान घाव में मिल सकता है किया जाना चाहिए. योडिद समाधान के साथ तैयार क्षेत्र जीवाणुरहित. 4. Laminectomy अक्सर परिवर्तन और / या प्रक्रिया के दौरान दस्ताने बाँझ. माउस पृष्ठीय पक्ष सिर पर छोड़ दिया की ओर इशारा करते हुए (अगर आप सही हाथ कर रहे हैं) के साथ स्थिति. बाँझपन को सुनिश्चित करने और केवल मुंडा क्षेत्र अवगत कराया है कि जानवर कपड़ा. Laminecomy साइट के बारे में थोरैसिक कशेरुकाओं T8 से T12 तक फैले पर एक ऊर्ध्वाधर चीरा (~ 1.3cm) बनाओ. बाएं हाथ में आयोजित Graefe संदंश के साथ, दृढ़ता से T9 (चित्रा 1 ए) पर स्पाइनल कॉलम सुरक्षित और माउस लिफ्ट के लिए रीढ़ की वक्रता अतिरंजना है. जंक्शन T10 और T11 के बीच, दो काँटेदार protrusions के बीच अंतरिक्ष स्कोर स्केलपेल का उपयोग करें. इसके अलावा ध्यान मांसपेशी परत दूर समाप्त करने के लिए हड्डी का पर्दाफाश (चित्रा 1 बी देख, सी) द्वारा जंक्शन बेनकाब . कैंची का उपयोग स्पष्ट मांसपेशियों लामिना से दूर और छोटे snips साथ डंडी के आसपास आगे. यह कशेरुकाओं के बीच एक छोटी सी जगह खुल जाएगा. और धीरे धीरे और नाजुक इस अंतर में कैंची की एक ब्लेड डालने और डंडी धज्जी. सुनिश्चित करें कि कैंची की वक्रता हमेशा laterally तैनात है, हड्डी से दूर है. दूसरी तरफ दोहराएँ. (चित्रा 1D, ई देखें) लामिना लिफ्ट कॉर्ड को बेनकाब करने के लिए और ध्यान से यह कटाव बंद. नहीं किसी भी मुफ्त या दांतेदार हड्डी के टुकड़े को पीछे छोड़ सुनिश्चित करें. (चित्रा 1F देखें) इंजेक्शन के लिए पहले किसी भी रक्त दूर साफ बाँझ कपास swabs के साथ. 5. कोशिकाओं इंजेक्शन सुई अखरोट के साथ हैमिल्टन सिरिंज सुई और संलग्न उन्हें पानी, तो 70% इथेनॉल के साथ कई बार निस्तब्धता द्वारा स्वच्छ, और अंत में HBSS. पानी, 70% इथेनॉल, या HBSS के साथ प्रत्येक भरने के बाद सवार डालें. सेल लोड करने के लिए सवार को हटाने और सुई नट ढीला और सुई backpressure रोकने के सिरिंज से दूर खींच द्वारा हैमिल्टन सिरिंज तैयार. सुनिश्चित करें कि सुई और अखरोट के सावधान हैंडलिंग बाँझ दस्ताने के साथ कर रहे हैं. विंदुक टिप में कक्षों की 15μl लोड और टिप कसकर सिरिंज के पीछे अंत में सिरिंज में कोशिकाओं लोड दबाएँ. 5mm के बारे में सवार सम्मिलित करें और तब सुई अखरोट कस. सवार संयुक्त राष्ट्र दबानातिल सेल निलंबन के कुछ सुई बाहर निकलने में देखा जाता है. सुनिश्चित करें कि वहाँ सिरिंज में कोई बुलबुले हैं और सिरिंज क्षैतिज स्थिति में गंभीरता से एक ढाल बनाने से कोशिकाओं को रोकने के नीचे रखना. Spinalis dorsi T8 और T9 (चित्रा 2B, सी) के spines को जोड़ने मांसपेशियों द्वारा laminectomized माउस की पकड़ ले लो . बाएँ (अनुलंब) micromanipulator हाथ hemostat दबाना इतना है कि माउस के सामने पंजे हवा में हैं और इसके पीछे पंजे हल्के आंकड़े और 2A 2B में बाँझ कागज तौलिए के एक मंच के रूप में छू. सही micromanipulator हाथ (70 ° कोण पर) सिरिंज संलग्न और clamping के पहले निम्नतम संभव स्थिति के लिए सिरिंज स्लाइड. कागज तौलिये के खिलाफ अपनी पूंछ लगाए हैं और धीरे धीरे सिरिंज (चित्रा 2B) कम करके माउस स्थिर. सुई की हड्डी की ओर लोअर और विपरीत गोलार्द्ध में पृष्ठीय midline (चित्रा 2C) के माध्यम से सुई 1mm डालें. सुई की नोक ग्रे मामले में केंद्रीय नहर के पास होना चाहिए. धीरे धीरे कोशिकाओं की 2.5μl इंजेक्षन. 1μl / 5 सेकंड की दर पर इंजेक्षन. कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने के बाद, एक 10 सेकंड प्रतीक्षा और सुई एक मोड़ के एक दसवें वापस लेना एक समय में हर 10 सेकंड तक सुई की हड्डी के बाहर है. सेल निलंबन के संभावित तपका ध्यान. जल्दी वापस लेना सिरिंज और यह micromanipulator हाथ से अलग है. सिरिंज क्षैतिज लेटाओ नीचे. रिलीज माउस और suturing तालिका करने के लिए स्थानांतरण. 5.7-5.14 कदम दोहराएँ प्रत्येक माउस के लिए जब तक सिरिंज खाली कर दिया है. जीवाणुरहित उपकरण (अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ में) और पशुओं के बीच सुई (इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा). कोशिकाओं को त्यागें और पुनः लोड यदि clumping को दिखाई देता है. भार के बीच 5.1 कदम के रूप में सिरिंज साफ. 6. Sutures और पोस्ट सेशन देखभाल चीरा सिवनी. सीवन सुई चीरा के दोनों पक्षों पर सतही प्रावरणी में डाला जाता है. धागा के माध्यम से अनुभूत है, सतही प्रावरणी एक साथ खींच (चित्र 3A), जिससे उजागर हटा लामिना की साइट पर रीढ़ की हड्डी को कवर. त्वचीय त्वचा या पीठ के कंकाल की मांसपेशी जुड़ी मांसपेशियों सीवन मत करो. के माध्यम से पूरे धागा खींचो, 1 / 2 लगभग ". सुई धारक, तीन समुद्री मील का गठन कर रहे हैं और धागा बंद के रूप में संभव के रूप में गाँठ छंटनी की है का उपयोग छोड़ने. चीरा त्वचा (चित्रा 3B) के लिए दो से तीन स्टेपल (चीरा के आकार पर निर्भर करता है) को लागू करने के द्वारा बंद करो. ध्यान से त्वचा माउस से दूर खींचने के लिए अंतर्निहित मांसपेशियों स्टैपल से बचने. 26G3 / 8 सुई का प्रयोग कम चीरा से दूर वापस में उप cutaneously 0.5ml lactated Ringers इंजेक्षन. अपने पिंजरे में वापस प्लेस माउस. यह सुनिश्चित करने के लिए यह आराम से साँस जबकि संज्ञाहरण के तहत, माउस पिंजरे में अपने पक्ष पर रखा होना चाहिए, सर्जरी साइट और पिंजरे बिस्तर के बीच संपर्क से बचने में सक्षम है. पिंजरों हीटिंग पैड पर रखा जाना चाहिए. चूहे संज्ञाहरण के बाद बंद पहनता है खून बह रहा उतरे सुनिश्चित करने के लिए निगरानी कर रहे हैं, sutures के बंद रहता है, और है कि चूहों पूर्व सर्जरी की गतिशीलता से लौटने. चूहों एनाल्जेसिक (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा) buprenorphine सर्जरी के बाद के साथ एक समय समझो. सुनिश्चित करें बिगड़ा चूहों पर्याप्त भोजन और पानी के लिए उपयोग किया है: पानी की बोतलें विस्तारित 3.5 इंच spouts और चूहों कि हाथ खिलाया पानी और / या उच्च कैलोरी आहार अनुपूरक (Nutri-सीएएल, Tomlyn) चलने में असमर्थ हैं के साथ फिट कर रहे हैं. 7. प्रतिनिधि परिणाम: वांछित परिणाम इंजेक्शन के दौरान सेल निलंबन के तपका की कमी से और प्रक्रिया के बाद रीढ़ की हड्डी के अक्षुण्ण रूप से पहचाने जाने योग्य हो जाएगा. यह अंत करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है laminectomy के दौरान और इंजेक्शन के दौरान माउस रीढ़ की हड्डी पर उज्ज्वल है और प्रत्यक्ष प्रकाश है. इष्टतम प्रकाश फाइबर ऑप्टिक रोशनी (2A चित्रा) के द्वारा मदद की है. चित्रा 1 – Laminectomy (ए) एक बार T9 कशेरुका मजबूत Graefe संदंश के साथ आयोजित किया जाता है, (बी, सी) T10 और T11 के बीच स्केलपेल के साथ रीढ़ की हड्डी सूक्ष्म कैंची की प्रविष्टि को सुविधाजनक बनाने के स्कोर. (डी) ध्यान से T10 और T11 (तीर और इनसेट ई,) के बीच अंतरिक्ष के माध्यम से सूक्ष्म कैंची और स्लाइड प्रत्येक पक्ष पर pedicles (डैश, ई) में कटौती पृष्ठीय लामिना मुफ्त. (एफ) लामिना पलटें rostrally और इसे काट. चित्रा 2. एनएससी इंजेक्शन (ए) सही बांह पर एक 70 कोण पर बाएं हाथ और हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ी माउस पकड़े hemostat साथ micromanipulator के सामान्य सेटअप. (बी) hemostat spinalis dorsi T8 और T9 के spines को जोड़ने मांसपेशियों पकड़. (सी) सुई टी के माध्यम से उतारा हैवह midline और विपरीत गोलार्द्ध पर ग्रे बात है, केंद्रीय नहर प्रॉक्सिमल में. चित्रा 3. Sutures और घाव बंद (ए) Sutures चीरा के दोनों पक्षों पर सतही प्रावरणी के लिए लागू कर रहे हैं . (बी) चीरा 2-3 के रूप में की जरूरत स्टेपल (एक स्टेपल एक 3 ज़रूरत घाव पर दिखाया) के साथ बंद कर दिया है.

Discussion

एक अच्छी तरह से मार डाला प्रत्यारोपण मुख्य रूप से सावधान और कक्षों की laminectomy इंजेक्शन पर टिकी हुई है. रीढ़ की हड्डी के प्राथमिक laminectomy के दौरान से बचने ख़तरा हानिकारक है. यह प्रक्रिया ही के दौरान या तेज हड्डी प्रक्रिया के बाद पीछे छोड़ दिया टुकड़े की वजह से नुकसान हो सकता है. इन से बचने सुनिश्चित करें कि घुमावदार सूक्ष्म कैंची के अंक हमेशा की हड्डी से दूर का सामना कर रहे हैं और ध्यान से laminectomized रीढ़ की हड्डी की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी हड्डी टुकड़े को मंजूरी दे दी हैं और शेष कशेरुका संरचना खुलकर नहीं फैला हुआ करता है या दांतेदार किनारों कि.

जैसा कि पहले उल्लेख किया है, तपका का पता लगाने के संभव हो सकता है अगर प्रकाश चमकीले और सीधे इंजेक्शन के दौरान उजागर रीढ़ की हड्डी पर चमक रहा है. तपका सबसे 30 गेज सुई (बनाम 33 गेज) के साथ और इंजेक्शन भी तेजी से किया जाता है अगर होने की संभावना है. हालांकि इस प्रोटोकॉल हमें अच्छा परिणाम दिया है, अब दूसरों को सूचित किया है अवधि सुई निम्नलिखित इंजेक्शन ^8,9 retracting से पहले (5 मिनट) इंतज़ार कर रही है. इसके अलावा, छोटे गेज सुई बेहतर कर रहे हैं, लेकिन हमने देखा है कि कुछ कोशिकाओं को भी आसानी से जब 33 गेज सुई के माध्यम से पारित lysed.

क्षमता को अधिकतम करने के लिए, एक प्रत्यारोपण टीम के चार अलग अलग स्टेशनों (प्रस्तुत करने माउस, laminectomy, इंजेक्शन, और sutures) मैनिंग वांछनीय है. इसके अलावा, प्रत्येक प्रक्रिया के लिए समय के लिए समय कोशिकाओं बर्फ पर इंतजार कर रहे हैं को कम करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, हम चार (सिरिंज में से प्रत्येक लोड में खुराक की संख्या) के समूहों में हमारे चूहों प्रत्यारोपण, व्यक्ति कोशिकाओं को इंजेक्शन सिरिंज के बाद तीसरे माउस laminectomized किया गया है लोड हो रहा है शुरू होता है और चूहों की तैयारी व्यक्ति निम्नलिखित anesthetize चाहिए पिछले समूह का दूसरा माउस के बाद समूह laminectomized किया गया है. इस तरीके में, हम के बारे में 3 घंटे में 40 चूहों में कोशिकाओं (या नियंत्रण मीडिया) प्रत्यारोपण भले ही प्रत्येक माउस लगभग 30-40 मिनट ले जाएगा कर सकते हैं.

कुछ CNS विकारों के उपचार के लिए सेल प्रतिस्थापन उपचार ^{नैदानिक} ​​10 परीक्षणों में वर्तमान में कर रहे हैं . वहाँ के लिए कोई विकल्प नहीं एनएससी प्रत्यारोपण और वायरल प्रेरित demyelination एमएस के एक महत्वपूर्ण मॉडल के उपयोग की सुविधा के साथ चूहों की रीढ़ की हड्डी डोरियों में एनएससी के engraftment के लिए हमारे प्रोटोकॉल के vivo मॉडल में है और अन्य मॉडलों के लिए भी आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है.

Materials

Name of the reagent/equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ketaject	Phoenix Parmaceuticals	NDC 57319-542-02
Xylazine Hydrochloride	MP Biomedicals	158307
Nair	Church & Dwight Co.
10μl Hamilton Syringe w/ Removable needle	Hamilton Company	7635-01
Hamilton Needles, 30G or 33 G, ½ inch, 30° bevel	Hamilton Company	7803-077803-05	Test the viability of your cells following passage through needles to identify the best gauge to use
Micro Scissors	World Precision Instruments	555500S
Small Graefe Forceps	FST	11053-10
Stereotaxic	KOPF Instruments	Model 1772 Universal Holder
Stereotaxic	KOPF Instruments	Model 1773 Electrode Holder
Stereotaxic	KOPF Instruments	Model 902 small animal stereotaxic
Stereotaxic	KOPF Instruments	Model 960 left electrode carrier
Sutures	Ethicon	95057-064
Lactated Ringers	Hospira	NDC 0409-7953-03
Staples	Fine Science	12032-07
Hemostat	FST	13010-12
Scalpels, sizes 10,11	Fisher	268878, 268879
Sutures	ETHICON	1676G	size 5-0, 3/8″ circle, 19mm needle, 45cm braided thread
Reflex 7 wound clip applicator	FST	12031-07
7mm Reflex wound clips	FST	12032-07
Olsen-Hegar needle holder	FST	12502-12