Zebrafish Pronephros के लेजर एबलेशन गुर्दे उपकला पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए
Summary
मानव में तीव्र गुर्दे चोट (अकी) उपकला कोशिकाओं है कि गुर्दे nephrons शामिल के लिए नुकसान की वजह से एक आम नैदानिक समस्या है, और अकी 50-70% की उच्च मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है<sup> 1</sup>. उपकला कोशिका विनाश के बाद, नेफ्रॉन एक सीमित को पुनर्जीवित करने की क्षमता है, हालांकि तंत्र और सीमाओं कि इस घटना का मार्गदर्शन खराब समझ रहना. इस वीडियो लेख में, हम zebrafish भ्रूण गुर्दे में गुर्दे नेफ्रॉन कोशिकाओं के लक्षित लेजर पृथक, या pronephros के लिए हमारी तकनीक का वर्णन. हमारी नई विधि अकी के nephrotoxicity प्रेरित मॉडल के पूरक हैं और कि गुर्दे नेफ्रॉन में उपकला उत्थान के साथ जुड़े रहे हैं सेल और आणविक परिवर्तन की एक उच्च संकल्प समझ हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.
Protocol
Discussion
zebrafish एक व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता मॉडल जीव विज्ञान के कई पहलुओं भर में है, आवेदन जिनमें से 6 बढ़ रहे हैं. अकी जैसे गुर्दे की बीमारियों के अध्ययन में zebrafish मॉडल प्रणाली के रोजगार महत्वपूर्ण टिप्पणियों के लिए नेतृत्व किया गया है और एक अच्छा मॉडल के लिए गुर्दे की चोट 7,8 अध्ययन किया जाना जारी रहेगा. एक जीनोम अनुक्रम निर्धारण किया गया है कि और जगह में कई आणविक प्रोटोकॉल के साथ, यह तेजी से परिष्कृत zebrafish अनुसंधान कि ट्रांसजेनिक मॉडल, जीन पछाड़ना और misexpression अध्ययन का इस्तेमाल करने के लिए आसान हो गया है. zebrafish बड़े पीढ़ी के आकार और अच्छी तरह से परिभाषित विकास के चरणों के साथ एक छोटी जीवन चक्र है. इसके अलावा, zebrafish भ्रूण और लार्वा चरणों काफी हद तक पारदर्शी हैं, इमेजिंग अध्ययन जीव के विच्छेदन के बिना संभव बना. भ्रूण और लार्वा चरण के दौरान, zebrafish एक pronephric गुर्दे दो नेफ्रॉन, जो इन विकास timepoints के दौरान दिखाई रहना शामिल है. Zebrafish pronephric नेफ्रॉन उनके स्तनधारी समकक्षों की संरचना और समारोह में अनुरूप हैं, यह तीव्र गुर्दे की विफलता 4,5 अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल बनाने.
गुर्दे मानव और अन्य रीढ़ के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, अंग है कि तरल चयापचय अपशिष्ट के शरीर cleanses के रूप में सेवारत है. इस सफाई समारोह गुर्दे nephrons रक्त फिल्टर, और तब संशोधित करने के लिए छानना स्राव के लिए नाइट्रोजन कचरे को इकट्ठा और साथ ही तरल और इलेक्ट्रोलाइट संतुलन को बनाए रखने की क्षमता पर टिकी हुई है. Nephrons एक रक्त फिल्टर, उपकला छोटी नली, वाहिनी में और नाली शामिल हैं. सभी तीन भागों के संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता नेफ्रॉन समारोह का अभिन्न अंग है. गुर्दे के लिए विभिन्न अपमान nephrotoxins के लिए जोखिम, ischemia, या मूत्र बहिर्वाह इलाकों की बाधा सहित, 1 अकी में परिणाम कर सकते हैं. अकी की विकृति अक्सर तीव्र ट्यूबलर परिगलन 1,2 के साथ जुड़ा हुआ है. नैदानिक अध्ययनों से पता चला है कि गुर्दे की विफलता आगामी एक मृत्यु दर है कि 70-80% से कहीं भी और गुर्दे की विफलता के कारण और संदर्भ पर निर्भर करता है रेंज कर सकते हैं. हालांकि, तेजी से और अकी के अंतर्निहित कारण का निदान उत्क्रमण तेजी परिगलित नेफ्रॉन tubules के उत्थान के माध्यम से वसूली के साथ जुड़ा हुआ है. हाल के भाग्य मानचित्रण अध्ययन से पता चला है कि प्रमुख सेल की आबादी है कि क्षतिग्रस्त नेफ्रॉन tubules repopulates उपकला कोशिकाओं है कि आसन्न रिहाई 12 क्षेत्रों से उत्पन्न कर रहे हैं. इन निष्कर्षों संभावना है कि गुर्दे की स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं प्रक्रिया में भाग ले सकते हैं समाप्त नहीं है, और स्वतंत्र रिपोर्ट का सुझाव दिया है कि अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं गुर्दे 13 उत्थान के लिए योगदान कर सकते हैं. यह स्पष्ट है कि जारी रखा जांच करने के लिए बेहतर गुर्दे की उपकला उत्थान के सेलुलर स्रोतों को हल करने के लिए आवश्यक हैं.
दोनों नेफ्रॉन उत्थान और विकास mesenchymal और उपकला phenotypes के बीच सेलुलर राज्य में स्विच की घटना का हिस्सा है. नेफ्रॉन विकास के दौरान, mesenchymal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं एक स्थिर phenotype में अंतर है, एक तहखाने झिल्ली को संलग्न करने के लिए ट्यूबलर 3 उपकला फार्म. speculated है तीव्र गुर्दे की विफलता के बाद उपकला कोशिकाओं के प्रवासी घटना एक mesenchymal phenotype में dedifferentiation आवश्यक है. दिलचस्प है, हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि क्षतिग्रस्त गुर्दे में mesenchymal कोशिकाओं के विकास के दौरान 14 mesenchymal सेल करने के लिए इसी तरह की एक अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल प्रदर्शन. विभिन्न रिपोर्टों कोशिका आसंजन अणु, मैट्रिक्स प्रोटीन, साइटोकिन्स और chemokines में परिवर्तन का पता चला है. उपकला संक्रमण के लिए प्रस्तावित mesenchymal के बाद, कोशिकाओं को एक तहखाने झिल्ली पर पुनः और ट्यूबलर उपकला गतिविधियों reinitiate. इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण जीनों का निर्धारण करने के लिए हमारी प्रयोगशाला और दूसरों के लिए अनुसंधान का एक विषय होना जारी है. के लिए इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कारक स्पष्ट काम के बहुत किया जाना है, लेकिन क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति gentamicin के प्रभाव के अध्ययन के द्वारा की शुरुआत है.
अकी और गुर्दे की विफलता gentamicin की वजह से nephrotoxic 15 चिकित्सा में इस्तेमाल यौगिकों की व्यापकता पर विचार के लिए प्रासंगिक है. ग्राम नकारात्मक बैक्टीरियल संक्रमणों के लिए एक इलाज के रूप में प्रयुक्त, aminoglycosides के प्रशासन के 10-25% मामलों में गंभीर चोट की ओर जाता है है. दवा के नकारात्मक सेलुलर प्रभाव के एक बहुतायत का कारण बनता है, एक साथ या कई ट्यूबलर कोशिकाओं में apoptosis परिगलन में जिसके परिणामस्वरूप. अध्ययन दवा megalin और cubulin कि endocytosis में शामिल है द्वारा गठित एक जटिल के लिए preferentially बाँध पाया है. इन अणुओं प्रॉक्सिमल tubule के उपकला कोशिकाओं में बहुतायत में पाए जाते हैं, हालांकि वे इन कोशिकाओं में अभिव्यक्ति तक सीमित नहीं हैं. सेलुलर oxidative तनाव के शामिल है, vasoconstrictors की रिहाई के सेलुलर एटीपी, hypoxia की कमी, phospholipases के निषेध में जिसके परिणामस्वरूप संकेत के माध्यम से, gentamicin और इसी तरह एंटीबायोटिक दवाओं के कारणऔर उपकला कोशिकाओं में apoptosis परिगलन. इसके अतिरिक्त, एंटीबायोटिक दवाओं नेफ्रॉन रक्त फिल्टर (glomerulus) में mesangial संकुचन ट्रिगर, glomerular निस्पंदन दर में एक बूंद में जिसके परिणामस्वरूप और नकारात्मक गुर्दे की क्षमता को खून फिल्टर फेरबदल. प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, immunostimulatory अणुओं, और phospholipases के सक्रियण के उत्पादन नेफ्रॉन में फैलाना प्रभाव है, एक भयावह विकृति है कि तीव्र गुर्दे की विफलता की ओर जाता है बनाने.
जबकि gentamicin और इसी तरह एंटीबायोटिक अध्ययन किया गया है और गुर्दे उत्थान के अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण उपकरण होना जारी रहेगा, वे एक सटीक है कि कुछ सवालों के समाधान में उपयोगी हो सकता है है की कमी है. एक लेजर पृथक इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि के साथ संयोजन के रूप में zebrafish का उपयोग हमारी प्रणाली इस तरह के एक सटीक अनुसंधान उपकरण की जरूरत का जवाब है. लेजर पृथक शोधकर्ताओं गुर्दे tubule के फोकल क्षेत्रों में सेल विनाश प्रेरित करने के लिए, से लेकर की अनुमति देता है एक छोटे (2-3) बेजोड़ परिशुद्धता के साथ एक बड़ी आबादी (5-10) के लिए. इस प्रोटोकॉल में, हम dextran – conjugates के लिए जोखिम के लिए preferentially प्रॉक्सिमल छोटी नली उपकला आबादी लेबल के एक पहले से विकसित विधि का उपयोग. वैकल्पिक रूप से, ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों है कि tubule के एक या एक से अधिक क्षेत्रों में हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, cadherin17: EGFP ट्रांसजेनिक zebrafish बाहर का छोटी नली क्षेत्रों में मजबूत प्रतिदीप्ति प्रदर्शन (हालांकि प्रॉक्सिमल आबादी में कमजोर), और उत्थान के अन्य छोटी नली क्षेत्रों में अध्ययन 16 लिए मूल्यवान हो सकता है . नेफ्रॉन की दृश्यता समय चूक वीडियो रिकॉर्डिंग समय पर सेलुलर परिवर्तन के लिए सक्षम हो जाएगा. जब स्वस्थानी संकरण या immunohistochemistry में पूरे माउंट के रूप में जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के साथ युग्मित, शोधकर्ताओं समय पर नेफ्रॉन में आणविक परिवर्तन का पता लगा सकते हैं. साथ में ले ली, ऐसी रणनीतियों के लिए घटनाओं कि भाप बनकर उड़ जब गुर्दे की उपकला कोशिकाओं को नष्ट कर रहे हैं की एक अधिक गतिशील समझ बनानी शुरू कर सकते हैं.
हमारे लेजर पृथक मॉडल के प्रमुख चेतावनी है कि यह शारीरिक स्थिति है कि मानव अकी में भाप बनकर उड़ की आंशिक पहलुओं पुनरावृत्ति कर सकते हैं. सेल तात्कालिक शारीरिक क्षति के माध्यम से प्रेरित मृत्यु की घटनाओं का झरना है कि कोशिकाओं में परिगलन की ओर जाता है से अलग है, और के रूप में इन विभिन्न microenvironments में इस तरह के humoral कारकों के समान नहीं हो सकता. इसके अतिरिक्त, वहाँ गुर्दे चोट दौरान प्रेरित apoptosis के सबूत मौजूद है, और यह ज्ञात नहीं है कि क्या इस तरह के परिणाम एक लेज़र के साथ निम्नलिखित अपमान भाप बनकर उड़ है. हालांकि, सेल संस्कृति के रूप में सिर्फ एक उपकरण है कि बेहतर जवाब कुछ सवाल है कि एक अत्यधिक नियंत्रित वातावरण होना अनिवार्यता रहती है, लेजर पृथक के रूप में एक उच्च अकी के vivo मॉडल में नियंत्रित की सेवा करेंगे. जैसे, अंतर्दृष्टि zebrafish में गुर्दे की उपकला पृथक अध्ययन से हुई संभावना मौलिक अंतर्दृष्टि है कि अन्य गुर्दे की चोटों की जांच के लिए लागू किया जा सकता है और संभवतः मानव में बेहतर निदान बनाने के लिए इस्तेमाल किया की खोज को बढ़ावा देंगे.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अकी जीव विज्ञान और zebrafish तकनीक की उपयोगी चर्चा, अपने methylcellulose नुस्खा साझा करने के लिए और सी. Diep के लिए Wingert प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. लेखकों को भी उत्कृष्ट हमारे zebrafish कॉलोनी के लिए चल रहे पशुपालन देखभाल प्रदान करने के लिए Notre Dame सेंटर के Zebrafish अनुसंधान के लिए स्टाफ सदस्यों के लिए हमारे आभार व्यक्त करना चाहते हैं. अनुदान NIH-NIDDK DK083512 पुरस्कार, और उदार प्रयोगशाला Notre डेम विश्वविद्यालय से शुरू हुआ धन, से अनुदान के इस काम का समर्थन किया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Embryo dishes | Falcon | 35-1005 |
| Dissection forceps | Roboz | RS-5010 |
| Injection needles | Sutter Intruments | BF100-50-10 |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 16500-500 |
| 40 kilodalton (kD) Dextran-fluorescein | Invitrogen | D1845 |
| Plastic transfer pipet | Samco Scientific, Fisher | 204, 13-711-23 |
| Tricaine | Sigma | E10521 |
| Methylcellulose | Sigma | M0262 |
| Depression slide | Fisher | S175201 |
| 12-well dish | Corning | 3512 |
References
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