Cet article présente une cytométrie en flux à base méthode pour étudier la composition immunitaire des aortes. Le document montre aussi une technique supplémentaire qui permet d'examiner l'adventice environnante et paroi de la cuve séparément. Cette méthode ouvre des possibilités d'effectuer des analyses phénotypiques des leucocytes aortique et appliquer plusieurs tests immunologiques pour les études de l'athérosclérose.
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Article de méthode
Débit analyse par cytométrie de cellules immunitaires dans aortes murin
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'athérosclérose est un processus inflammatoire chronique des navires de taille moyenne et grande taille qui se caractérise par la formation de plaques constituées de cellules de la mousse, les cellules immunitaires, les cellules vasculaires endothéliales et musculaires lisses, les plaquettes, la matrice extracellulaire, et un noyau riche en lipides avec une nécrose extensive et fibrose des tissus environnants. 1 Le bras innée et adaptative de la réponse immunitaire sont impliqués dans l'initiation, le développement et la persistance de l'athérosclérose. 2, 3 Il existe un important corpus de preuves que différents sous-ensembles des cellules immunitaires, telles que les macrophages, dendritiques cellules, les lymphocytes T et B, sont présents dans les aortes des souris saines et l'athérosclérose sujettes 4. En outre, les cellules immunitaires se trouvent dans l'adventice aortique entourant ce qui suggère un rôle important de ce tissu dans l'athérogenèse. 2
Depuis quelque temps, la détection quantitative des différents types de cellules immunitaires, leur état d'activation, et la composition cellulaire dans la paroi aortique a été limitée par RT-PCR et les méthodes immunohistochimiques pour l'étude de l'athérosclérose. Peu de tentatives ont été faites pour réaliser la cytométrie en flux utilisant aortes humaines, et un certain nombre de problèmes, comme une autofluorescence élevée, ont été rapportés 5,6. Homme plaques d'athérosclérose ont été digérés par la collagénase 1, et les cellules libres ont été recueillies et colorées pour CD14 + / CD11c + pour mettre en évidence des cellules spumeuses macrophages dérivés. Dans cette étude, une "maquette" canal a été utilisé pour éviter les faux positifs coloration. 6 matériaux nécrotiques s'accumulent au cours du processus de digestion donner lieu à une grande quantité de débris qui génère une autofluorescence élevées dans les échantillons de l'aorte. Pour résoudre ce problème, un panneau de contrôles positifs et négatifs a été proposée, mais seulement double coloration pourrait être appliqué dans ces échantillons. Nous avons développé un nouveau flux cytométrie méthode basée sur 7 pour analyser la composition des cellules immunitaires et de caractériser l'activation, la prolifération, la différenciation des cellules immunitaires dans l'aorte saine et l'athérosclérose sujettes. Cette méthode permet l'étude de la composition des cellules immunitaires de la paroi aortique et ouvre des possibilités d'utiliser un large éventail de méthodes immunologiques pour les enquêtes sur les aspects immunitaires de cette maladie.
Protocole
1. Isolement des aortes murines
L'approbation du comité institutionnel IACUC de la procédure est nécessaire pour travailler avec des souris.
- Préparer heparinzed PBS en ajoutant 1000 unités d'héparine sodique à 50 ml de PBS et en inversant le tube pour mélanger. Préparer un tube de collecte vide pour le sang et un tube contenant du PBS pour chaque aorte à être collectées. Conservez tous les tubes sur la glace.
- Hépariner une seringue pour prélever du sang (0,1 ml d'Héparine sodique 1000 U / ml), préparer les outils chirurgicaux (deux paires de pinces courbes, une paire de ciseaux à disséquer, et une paire de microshears....
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Discussion
Ici, nous présentons une méthode cytométrie en flux à base de l'enquête de la composition des cellules immunitaires des aortes murines. L'avantage majeur de cette méthode est la capacité d'analyser l'aorte cellules immunitaires à un niveau simple cellule et de caractériser l'état d'activation des leucocytes aortique. Cette méthode n'est pas limitée aux aortes murines et nous (données non publiées) et d'autres 10 a utilisé cette approche pour analyser des spécimens humains tels .......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé de subvention: PO1 HL55798 (à KL) et l'American Heart Association Scientifique de subvention au développement 0525532U (EG).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Matériau | Nombre de catalogue | Société | |
| Collagénase XI | C7657 | Sigma-Aldrich | |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| DNase I, de type 2 | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Collagénase I | C0130 | Sigma-Aldrich | |
| Collagénase II | LS004174 | Worthington Biochemical Corporation | |
| Élastase | LS002292 | Worthington Biochemical Corporation |
Références
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-2341 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Hansson, G. K., Libby, P.
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Réimpressions et autorisations
