我们提供了一种改进的从高盐度微生物垫中提取高分子量DNA的方案。在DNA提取和纯化之前，先将微生物细胞从微生物垫基质中分离出来。该步骤可提高DNA的浓度、质量和片段大小。本方案也可用于其他难处理样品的DNA提取。
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摘要
摘要
宏基因组数据的成功且准确的分析与解读依赖于高效提取高质量、高分子量（HMW）的群落DNA。然而，环境样本（如微生物席）常常难以获得高浓度、高质量的高分子量DNA。高盐度微生物席含有大量胞外多聚物（EPS）1 和盐分，可能抑制提取DNA的下游应用。针对难处理样本的DNA提取通常采用直接且剧烈的方法。这些方法常被使用的原因是，微生物席中的EPS作为一种黏附性基质，会在直接裂解过程中结合DNA2,3。由于采用了更剧烈的提取方法，DNA往往被断裂成较小的片段4,5,6。
因此，该DNA不适合用于大片段插入载体的克隆。为了克服这些限制，我们报道了一种改进的方法，可从高盐度微生物垫中提取高质量和高产量的高分子量（HMW）DNA。我们采用了一种间接方法，通过匀浆和差速离心将微生物细胞从微生物垫基质中分离出来。随后结合机械和化学手段，从分离得到的微生物细胞中提取并纯化DNA。本方案每克微生物垫样品可获得约2 μg的HMW DNA（35–50 kb），A260/280比值为1.6。此外，16S rRNA基因的扩增7结果表明，该方案能够最大程度减少或消除污染物可能带来的抑制作用。我们的研究结果为从微生物垫中提取HMW DNA以开展功能宏基因组学研究提供了适宜的方法，也可能适用于其他难以提取DNA的环境样品。
方案
1. 微生物细胞提取：
- 使用无菌研磨杵充分混匀微生物垫层。将约 30 g（湿重）均质后的垫层材料全部放入 Waring 匀浆器的无菌容器中，加入约 100 mL 的 1 M NaCl（或根据所用样品特定浓度），以中等速度匀浆 3 次，每次 1 分钟，每次间隔在 -20°C 冰箱中冷却 1 分钟。将匀浆液转移至 250 mL 离心瓶中，并用 1 M NaCl 补充至满体积。NaCl 溶液使用高压灭菌的去离子水配制，并经滤膜除菌。
- 在室温下使用涡旋振荡器（Vortex-GenieR2）以 150 rpm 振荡 30 分钟，进一步使微生物细胞从基质中脱离。
- 在 4°C 下以低速（500×g）离心 15 分钟。轻柔地将上清液转移至烧瓶中，尽量减少对沉淀物的扰动。
- 利用所得沉淀物，重复进行匀浆及步骤 1.2 和 1.3，共额外进行 4 次，每次在步骤 1.3 结束后向沉淀物中加入新鲜的 NaCl 溶液。每次 NaCl 提取所得的上清液均转移至新的烧瓶中。
- 合并 5 次细胞提取所得的上清液，分装为每份 200 mL，于 4°C 下以高速（25,000×g）离心 15 分钟。弃去上清液，将每份细胞沉淀重悬于 10 mL 2% 六偏磷酸钠溶液中，合并所有沉淀，并用 2% 六偏磷酸钠溶液定容至 200 mL。在室温下以 150 rpm 振荡洗涤细胞 30 分钟。此步骤结束后，应仅保留一支含有全部细胞的离心管，用于后续操作。
- 在 4°C 下以高速（25,000×g）离心 15 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 200 mL TE 缓冲液（含 50 mM EDTA）中，在室温下以 150 rpm 振荡洗涤 10 分钟。
- 在 4°C 下以高速（25,000×g）离心 15 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 15 mL TE 缓冲液（含 10 mM EDTA）中，分装为 200-μL 每份，于 -80°C 保存，待后续 DNA 提取时使用。
2. DNA 提取与纯化：
- 向200 μL微生物细胞等分试样中加入200 μL 5 M NaCl、200 μL 10% SDS和100 μL 14.3 M β-巯基乙醇，通过倒置轻柔混匀4–6次。
- 将混合物进行3轮冻融处理：先浸入液氮中2分钟，再在65°C水浴中解冻5分钟。最后一次解冻延长至10分钟。
- 加入200 μL 5 M醋酸钾（pH 5.5），冰上放置10分钟。在4°C下以10,000×g离心10分钟，使用宽口移液吸头将上清液转移至新管中。加入3 μL RNase A，在37°C孵育1小时。
- 加入等体积氯仿，轻轻倒置振荡混匀，然后在室温下以15,000×g离心10分钟。
- 使用宽口移液吸头小心将上层上清液转移至新管中，避免吸取上下层之间的白色界面层。重复氯仿抽提步骤一次。
- 向上清液中加入等体积预冷（-20°C）的异丙醇，冰上孵育30分钟以沉淀DNA。
- 在4°C下以最大转速（20,800×g）离心10分钟，使DNA形成沉淀。
- 弃去上清液，用1 mL预冷（-20°C）的70%乙醇洗涤DNA沉淀。
- 在4°C下以最大转速（20,800×g）离心10分钟，弃去上清液，重复70%乙醇洗涤一次，空气干燥DNA沉淀10分钟。再次重复70%乙醇洗涤。
- 将DNA重悬于25 μL TE缓冲液（10 mM EDTA）中，65°C温育5分钟。若使用多个离心管，将所有样品合并至同一管中，并用TE缓冲液补足体积至500 μL。
- 加入500 μL冰上预冷（或4°C）的20%聚乙二醇（PEG）（用1.2 M NaCl配制），轻轻倒置混匀，冰上孵育10分钟，然后在4°C下以最高速度离心10分钟使DNA沉淀。弃去上清液，用1 mL预冷70%乙醇洗涤DNA沉淀，空气干燥10分钟，最后将DNA重悬于30–50 μL TE缓冲液或分子生物学级水中。可通过65°C温育5分钟促进DNA重悬，并将DNA储存于-80°C。
3. DNA 纯度、浓度和大小测定：
- 使用 Nanodrop 1000 分光光度计或其他适当的仪器，通过测量 A260/280 和 A260/230 比值来确定 DNA 纯度。
- 根据制造商说明书，使用 Quant-iT dsDNA 检测试剂盒测定 DNA 浓度。
- 采用脉冲场凝胶电泳测定 DNA 片段大小。制备含 0.5X TBE 的 1% 琼脂糖凝胶，并在 CHEF Mapper XA 系统上使用以下参数：初始切换时间为 0.35 s，最终切换时间为 7.67 s，夹角为 120°，电场强度为 6.0 V/cm，采用线性渐变模式。用 1 x SYBR Green I 染色 30 分钟。每泳道上样总量为 700–1000 ng DNA。完整方案的简要形式见图 3。
代表性结果：
细胞提取：
连续的微生物细胞提取物（上清液）显示，随着提取次数的增加，提取物的浊度逐渐降低。这表明每次连续的细胞提取后，细胞数量有所减少。需要注意的是，每增加一次细胞提取步骤，都会增加污染的风险，因此应尽量减少细胞提取次数，以确保最终的细胞沉淀能够代表整体的微生物群落。其他污染来源则通过采用适当的实验室无菌技术加以控制。例如，溶液使用经高压灭菌的去离子水配制，并通过滤膜除菌；容器则通过酒精消毒、高压灭菌，并在紫外灯和紫外交联仪下处理。
DNA 浓度与质量测定：
该方案每克垫状样品可获得约 2 μg 的高分子量 DNA（35-50 kb）（图 4），A260/280 比值为 1.6，A260/230 比值为 0.7（表 1）。尽管 A260/230 比值偏低，但在另一项研究中并未观察到对下游分子应用（如 16S rRNA 基因的 PCR 扩增）产生抑制作用7。需要注意的是，来自高盐环境垫状样品的 DNA 主要存在两类污染源：胞外多糖（EPS）和盐类。因此，尽管已采取大量措施以减少这些污染物对下游应用的影响，但仍有可能残留微量污染物，从而影响 A260/230 比值。
DNA 大小测定：
脉冲场凝胶电泳采用脉冲电流并间歇性改变方向，导致DNA呈弥散条带，如图3所示。我们的实验方案获得的高分子量DNA大小约为35–50 kb。尽管部分DNA片段可能小于30 kb，但确保弥散条带中有部分DNA大于35 kb至关重要，因为fosmid克隆需要约40 kb的DNA插入片段，而较大的DNA片段更有利于完整生物合成途径的获取。在本研究中，我们将35 kb以上的DNA弥散条带切下并纯化，用于大插入片段载体克隆及其他分子生物学应用。
图1. 位于巴哈马伊柳塞拉岛的高盐度微生物席采样点（Big Pond）。
图 2. 本研究所用高盐度微生物席的横截面。该微生物席取自巴哈马伊柳塞拉岛的一个高盐度池塘。
图3. 微生物细胞提取、细胞裂解、提取及宏基因组DNA纯化过程中所涉及步骤的示意图。点击此处查看大图。
图4. 采用脉冲场凝胶电泳对提取的DNA进行分子量表征。M泳道为高分子量（HMW）标记物，泳道1和2为使用上述方案从伊留瑟拉高盐菌膜中提取的宏基因组DNA的重复样本。
| 提取方法 | 浓度 ng/g | A260/280 | A260/230 | |
| PEG | 重复 1 | 1806.1 | 1.64 | 0.76 |
| 重复 2 | 2010.8 | 1.61 | 0.75 |
表1. 从高盐环境微生物席中提取的DNA浓度与质量的测定。
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讨论
由于从复杂且高度多样化的微生物席样品中完全去除所有细胞并不现实，因此主要关注的问题是所提取的细胞在多大程度上能够代表整个微生物席群落。在之前的一项研究中，通过对微生物16S rRNA基因进行PCR-DGGE分析表明，本方案中所采用的五步细胞去除步骤所提取的细胞能够代表整个微生物席群落7。实际所需的细胞提取步骤数量可能因样品类型不同而有所变化。为了针对不同样品优化实验方案，建议先开展小规模的预实验，通过比较每一步细胞提取后所获得的微生物丰富度与原始群落的丰富度，以确定最佳的提取步骤数。
Fosmid 克隆需要用于文库构建的 35–40 kb HWM DNA8我们的方案获得的DNA片段大小在35–50 kb之间（图4），并已成功用于构建基于fosmid的宏基因组文库（未发表结果）。其他用于产EPS海洋细菌DNA提取的方案所获得的 ˜23 kb4在功能宏基因组学研究中，较大的DNA片段能够更广泛地获取编码生物合成途径以及功能行为的多种基因 9,10因此，高质量大分子量DNA是宏基因组学研究...
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致谢
本工作由美国国家科学基金会环境基因组学计划（资助号：EF-0723707）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| β巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 聚乙二醇 8000 | Promega Corp. | V3011 | 20%（溶于1.2 M NaCl中） |
| 乙酸钾 | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA 检测试剂盒 | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre Biotechnologies | MRNA092 | |
| 氯化钠 | VWR | BDH8014 | 适当浓度 |
| 十二烷基硫酸钠 | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% 水溶液 |
| 六偏磷酸钠 | EMD Millipore | SX0583-3 | 2% 的水溶液 |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA 系统 | 伯乐（Bio-Rad） | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 分光光度计 | 赛默飞世尔科技公司 | ND-1000 | |
| 涡旋振荡器 | Scientific Industries Inc. | ||
| 紫外交联仪 | UVP 公司 | ||
| 沃林搅拌器 | 沃林实验室 | LB10S |
参考文献
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