バイオマットから高分子量DNAの抽出

Summary

我々は、塩性微生物マットから高分子量のDNAを抽出するための改良されたプロトコルを提供しています。微生物細胞は、DNAの抽出と精製の前にマットのマトリックスから分離されています。これは、濃度、品質、およびDNAの大きさを高めます。プロトコルは、他の難治性のサンプルに使用することができる。

Abstract

メタゲノムデータの成功したと正確な分析と解釈は、質の高い、高分子量（HMW）のコミュニティDNAの効率的な抽出に依存しています。しかし、環境マットのサンプルは、しばしば高品質の、HMWのDNAの大規模な濃度を得るために困難をもたらす。塩性の微生物マットは高い細胞外高分子物質の量（EPS）1、抽出されたDNAの下流のアプリケーションを阻害する塩が含まれています。ダイレクトと厳しい方法は、しばしば難治性の試料からのDNA抽出に使用されています。マット、接着剤マトリックス、のEPSは直接溶解中にDNA ^2,3を結合するので、これらのメソッドは一般的に使用されています。厳しい抽出方法の結果として、DNAは、小さいサイズ^4,5,6に分割になります。

DNAは、このように大規模挿入ベクトルのクローニングには不適切となります。これらの制限を回避するために、我々は塩性微生物マットから良い質と量のHMW DNAを抽出するために改良された方法論を報告する。我々はブレンドと分画遠心法を通じて、背景のマットマトリックスからの微生物細胞の分離を伴う間接的な方法を採用。機械的および化学的手順の組み合わせは、抽出された微生物細胞からDNAを抽出精製するために使用された。我々のプロトコルは1.6の_280分の260比で、マットのサンプルのグラム当たりHMW DNA（35〜50キロバイト）の約2μgを得られます。また、16S rRNA遺伝子⁷の増幅は、プロトコルが汚染物質のいずれかの阻害効果を最小化または排除することができることを示唆している。我々の結果は、機能的なメタゲノム研究のためのバイオマットからHMWのDNAの抽出のための適切な方法論を提供し、DNA抽出が難しいされているから、他の環境試料にも適用可能である。

Protocol

1。微生物細胞の抽出：

1. 徹底的に混合することにより滅菌粉砕乳棒でバイオマットをホモジナイズする。場所は約全30ワーリングブレンダーの滅菌​​容器に均質化したマットの材料のg（湿重量）、1MのNaCl（または使用中のサンプルに特定の濃度）の約100mLを追加し、1分間、中程度の速度で三回をブレンド1分間-20℃の冷凍庫で断続的に冷却。 250mLの遠心ボトルにスラリーを移し、1 M NaClで、残りの空のボリュームを埋める。オートクレーブのDI水にNaCl溶液を準備し、それを殺菌するフィルタ。
2. さらに30分間室温でボルテックス（渦魔神^R 2）を用いて（150 rpm）し振とうすることにより、マトリックスからの微生物細胞を取り除く。
3. 4℃で15分間のための低速で遠心（500分の1グラム）ゆっくりと堆積物への最小限の障害でフラスコに上清を移す。
4. ペレット堆積物を使用して、ステップ1.3の末尾に、各堆積物ペレットに新鮮なNaClの添加でブレンドし、手順1.2と1.3はさらに4回繰り返します。各NaClの抽出からの上清を新しいフラスコに転送されます。
5. 4℃で15分間高速（25,000 × g）で200mLのアリコートに5セルの抽出と遠心の上清を組み合わせる℃に上清を廃棄し、2％ヘキサメタリン酸ナトリウム10mlに各細胞ペレットを再懸濁し、ペレットを組み合わせ、2％ヘキサメタリン酸ナトリウムを加えて200mlにボリュームを構....

Discussion

複雑かつ高度に多様な微生物マット試料からの全細胞の除去が実用的ではないことを考えると、主な関心事は、抽出された細胞は、全体的な微生物マットのコミュニティを表す方法もあります。以前の研究で、微生物の16S rRNA遺伝子のPCR - DGGE解析では、このプロトコルで使用する5つの細胞の除去の手順は、全体的な微生物マットのコミュニティ⁷の代表的な細胞を抽出することを示した。全体的な微生物群集の代表である細胞ペレット可能性が高いサンプルの種類に依存して変化する提供するために必要な細胞の抽出手順の実際の数。異なるサンプルに最適なプロトコル開発のために、小規模なパイロットスタディは、各セルの抽出工程は、元のコミュニティの豊かさに比較して後に回収した微生物の豊かさの経験的なテストを特徴とすることをお勧めします。

フォスミドクローン作成は、クローンライブラリーの構築⁸の35〜40キロバイトのHWM DNAを必要とします。我々のプロトコルは、35〜50キロバイト（図4）に至るまでのサイズでDNAが得られたと、正常フォスミドベースのメ​​タゲノムライブラ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
β-メルカプトエタノール	シグマアルドリッチ	M3148
ポリエチレングリコール8000	プロメガ	V3011	1.2 M NaClを約20％
カリウム酢酸	フィッシャーサイエンティフィック		フィッシャーサイエンティフィック
クワント- IT dsDNAをアッセイキット	インビトロジェン	Q33130
RNaseの	EPICENTRE	MRNA092
塩化ナトリウム	BDHケミカルズ	BDH8014	適切なコンク。
硫酸ドデシルナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	03-500-509	水の10％
ヘキサメタリン酸ソーダ	EMDケミカルズ	SX0583 - 3	水の2％
TBE	フィッシャーサイエンティフィック	BP1333 - 1
CHEF MapperのXAシステム	バイオラッドラボラトリーズ	170-3670
光度計1000分光	サーモサイエンティフィック	ND - 1000
ボルテックス	サイエンティフィックインダストリーズ株式会社
紫外線架橋剤	UVP
ワーリングブレンダー	ワーリング実験室	LB10S