Här föreslår vi enkla metoder för att framkalla syrebrist i cellodlingar och enkla tester för att utvärdera hypoxiska status kulturer.
Syrebrist definieras som en minskning eller syrebrist i organ, vävnader eller celler. Minskningen av syre spänning kan bero på ett minskat utbud i syre (orsaker är otillräckligt nätverk blodkärl, defekta blodkärl, och anemi) eller till en ökad konsumtion av syre i förhållande till utbudet (orsakad av en plötslig ökad cellproliferation ränta) . Hypoxi kan vara fysiologiska eller patologiska som i fast cancer 1-3, reumatoid artrit, åderförkalkning etc. … Varje vävnader och celler har olika förmåga att anpassa sig till denna nya tillstånd. Under hypoxi är hypoxi inducerbara faktor alfa (HIF) stabiliserats och reglerar olika gener som de som är inblandade i angiogenes eller transport av syre 4. Stabiliseringen av detta protein är ett kännetecken för hypoxi, därför upptäcka HIF rutinmässigt används för att screena för hypoxi 5-7.
I den här artikeln föreslår vi två enkla metoder för att framkalla syrebrist i däggdjursceller kulturer och enkla tester för att utvärdera hypoxiska status av dessa celler.
Celltillväxt och lönsamhet hypoxiska förhållanden varierar mycket beroende på vilka celltyper. Därför bör du justera mobilnummer eller antalet kulturer plattor du börja med att se till att du har tillräckligt med celler / proteiner för ditt experiment.
Den koboltklorid Metoden har fördelen att vara billig och snabb. Denna produkt härmar hypoxi genom att inducera HIF-1/3α men kan också reglera andra gener, se till att denna produkt är anpassad till ditt projekt genom att kontrollera vilka andra effekter det kan ha på funktion och fenotyp din celler oberoende av "härma- hypoxisk "effekt. Annat läkemedel används också för att efterlikna hypoxi är deferoxamin mesylate (DFO, som används vid 100 mikroM slutlig koncentration). Användningen av dessa läkemedel gör att experimentator att öppna kultur plattan / skål / kolv många gånger utan att påverka den "hypoxiska tillstånd".
Nivån av syre i gasblandningen kan variera beroende på dina experiment och celltyper som hypoxi värdena varierar beroende på vävnader och celltyper. En del celler hypoxisk i 5% O 2 andra behöver mindre än 1% O 2 att vara hypoxisk. 5% CO 2 läggs till gasblandningen för att stabilisera pH-värdet i kulturer, är resten av gasen oftast Nitrogen.
Hypoxiska kamrarna har fördelen av att inte använda läkemedel som kan växla cellens beteende oberoende av syre spänning. Dock kan inte alla typer av experiment göras som syre åter kommer in i kammaren vid varje öppning och därmed minskar hypoxi. Du bör överväga denna faktor i dina experiment, hypoxi / re-syresättning är en specifik tillstånd som kan påverka vissa celltyper. Ett alternativ är att använda hypoxi arbetsstationer (ansluten till färdigblandade gastankar eller gas blandning system) eller större hypoxi inkubator (hypoxi bearbetning kammare med handskfacket) som gör att experimentera för att ändra media och manipulera celler i ständig hypoxisk miljö. Olika hypoxiska kamrarna har kommersialiserats under det senaste decenniet och bör väljas i enlighet med laboratoriets används, projekt, utrymme, storlek och budget. Se alltid till god användning och skick din kammare för att garantera korrekt odlingsbetingelser. I allmänhet när du använder en kammare kan graden av hypoxi anpassas genom att välja olika gasblandningar (dvs 1%, 5% 10% syre).
När det gäller detektion av HIF-1α, är det viktigt att veta att vissa cancer cellinje uttrycka HIF-1α i normoxia. Det är därför viktigt att använda en normoxia-kontroll för att fastställa den basala nivån av HIF i dessa cellinjer. HIF-1α kan också finnas i normoxia i icke-maligna celler efter cell stimulering eller stress. Detta kan också inträffa om dessa celler är svalt, se till att din cellkulturer ordentligt foder och upprätthålls.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Anti-HIF-1α | Invitrogen | 458400 |
Cobalt (II) Chloride | Sigma | C8661-25G |
Incubator Chamber | Billups-rothenberg | MIC-101 |
HRE-Luciferase plasmid | Adgene | Plasmid 26731 |