Agrobacterium-medierad virusinducerade geners uttryck test på Bomull
Summary
Vi presenterar detaljerade protokoll för Agrobacterium-medierad virusinducerade geners uttryck (VIGS) analys i bomull. Tobaken skallra virus (TRV)-härledda VIGS vektorer utplacerades att inducera RNA tysta av bomull GrCLA1, Cloroplastos alterados 1-genen. Den albino fenotyp orsakas av tysta GrCLA1 observerades vid plantan skede inom 2 veckor efter ympningen.
Abstract
Bomull (Gossypium hirsutum) är en av de viktigaste grödorna i världen. Betydande insatser har gjorts på molekylär förädling av nya sorter. Den storskaliga genen funktionell analys i bomull har halkat efter de flesta moderna växtarter, sannolikt på grund av sin stora storlek genom, gen dubbelarbete och polyploidi, lång tillväxt cykel och motspänstighet för genetisk förändring 1. För att underlätta hög genomströmning funktionella genetiska / genetiska studier i bomull, försöker vi att utveckla snabb och effektiv övergående testmetoder för att bedöma funktioner bomull genen.
Virusinducerade geners uttryck (VIGS) är en kraftfull teknik som har utvecklats baserat på värden efter transkriptionella geners uttryck (PTGS) att undertrycka virus spridning 2,3. Agrobacterium-medierad VIGS har framgångsrikt tillämpats i ett brett spektrum av dicots arter som Solanaceae, Arabidopsis och arter baljväxter och monocots arter, inklusive korn, vete och majs, för olika funktionella genomiska studier 3,4. Eftersom detta snabba och effektiva metoden undviker anläggning omvandling och övervinner funktionell redundans, är det särskilt intressant och lämplig för funktionell genomforskning studie i grödor som bomull inte mottagliga för förändring.
I denna studie rapporterar vi den detaljerade protokoll från Agrobacterium-medierad VIGS system i bomull. Bland flera virala VIGS vektorer, invaderar tobak skallra virus (TRV) ett brett utbud av värdar och kan sprida sig kraftfullt genom hela anläggningen men ge lindriga symtom på hosts5. Att övervaka tysta effektivitet, GrCLA1, en homolog gen i Arabidopsis Cloroplastos alterados 1-genen (AtCLA1) i bomull, har klonats och in i VIGS binära vektorn pYL156. CLA1 genen är inblandad i kloroplast utveckling 6, och tidigare studier har visat att förlust-av-funktion AtCLA1 resulterade i en albino fenotyp på äkta blad 7, vilket ger en utmärkt visuell markör för ljuddämpning effektivitet. Vid ungefär två veckor efter Agrobacterium infiltration började albino fenotypen ska visas på den sanna blad, med 100% tysta effektivitet i alla replikerade experiment. Den tysta endogena genuttryck bekräftades också av RT-PCR-analys. Betecknande nog kunde tysta förekomma kraftigt i alla de sorter vi testade, inklusive olika odlas kommersiellt sorter i Texas. Denna snabba och effektiva Agrobacterium-medierade VIGS analysen ger ett mycket kraftfullt verktyg för snabb storskalig analys av genen funktioner på arvsmassan-nivå i bomull.
Protocol
Discussion
VIGS har visat sig vara ett kraftfullt verktyg inom funktionell genomik analys av övergående knacka ner uttrycket av endogena gener. I denna studie har vi utvecklat en Agrobacterium-medierad VIGS genom att använda en TRV-baserade binär vektor. Bomullen CLA1 (GrCLA1) gen utvecklades som en visuell markör för att övervaka tysta effektivitet. Vi har genomgående fått 100% av geners uttryck effektivitet, vilket framgår av albino fenotyp som finns på den sanna löv i alla sorter testas, med början ungefä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma att Dr. SP Dinesh-Kumar och Yule Liu för TRV-VIGS vektorer, och Dr. Chuck Kenerley, Terry Wheeler, Jim Starr och Bayer CropScience för att ge bomullsfrön. Detta arbete har finansierats av NSF till LS och NIH till PH
Materials
| Name of the reagents and equipments | Company | Catalogue/serial number | Comments |
|---|---|---|---|
| Roller drum | Glas-Col, LLC. | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | BioRad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | BioRad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | BioRad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Infiltration buffer |
References
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. Virus-induced gene silencing in tomato. Plant J. 31, 777-786 (2002).
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
- Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
