嗅觉感官神经元的慢病毒介导的遗传操作和可视化在体内</em
Summary
我们提出了一种慢病毒基因操纵和单一的嗅觉感官神经元轴突的可视化技术及其终端树枝状<em>在体内</em>。
Abstract
一个精确的嗅觉电路的发展依赖于嗅觉的感觉神经元（OSN）轴突在嗅球（OB），突触目标准确的预测。 OSN的轴突的生长和定位的分子机制不能很好地理解。操纵基因的表达和随后的单一的OSN的轴突和他们的终端乔木形态的可视化迄今已具有挑战性。要在规定的时限内的单细胞水平上研究基因的功能，我们开发了基于慢病毒的技术，操纵在体内OSNs的基因表达。慢病毒颗粒，通过显微注射到嗅上皮（OE）的OSNs。表达盒，然后永久地整合到转OSNs基因组。绿色荧光蛋白表达确定感染OSNs，并概述了他们的整个形态，包括轴突终端乔木。由于显微注射和记者检测之间的周转时间短，基因功能研究，可以集中在一个很窄的发展时期。使用这种方法，我们三天内检测GFP的表达，只要3个月以下注射。我们已经取得的过度表达和shRNA慢病毒显微注射介导击倒。这种方法提供了详细的形态在体内的单个细胞水平OSN胞体和轴突，从而使候选基因在嗅觉发展功能特性。
Protocol
Discussion
微量注射慢病毒基因结构的永久转会到OSN的基因组DNA的结果。这种方法可以让我们的候选基因进行短期或长期的操作，通过过表达或shRNA介导击倒。此外，我们可以在现有的转基因小鼠，观察气味受体种群的合作本地化荧光标签单OSNs。显微注射是必需的慢病毒转导OSNs。我们曾试图进入鼻腔冲洗慢病毒悬浮导OSNs没有任何成功。因此，我们执行microinjections通过背鼻子表面，以提供病毒的OE OSN的细胞?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
支持这项研究是由美国国立卫生研究院DC052256和DC006015和NSF 0324769 Qg和T32 – DC008072符合BS。
Materials
Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).
Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.
Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.
References
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