Summary

Développement d'un type de cellule spécifique anti-VIH gp120 aptamères pour la livraison de siRNA

Published: June 23, 2011
doi:

Summary

Plusieurs 2'-fluoro aptamères d'ARN contre le VIH-1BA-L gp120 avec nanomole affinité sont isolées à partir d'une bibliothèque d'ARN en<em> In vitro</em> La procédure SELEX. Un nouveau double fonction inhibitrice anti-gp120 aptamère-siRNA chimère est créé et montre prometteur pour systémiques thérapie anti-VIH.

Abstract

L'épidémie mondiale d'infection par le VIH a créé un besoin urgent de nouvelles classes d'agents antirétroviraux. La puissante capacité d'interférents (SI) des ARN pour inhiber l'expression des transcrits d'ARN complémentaires est exploitée comme une nouvelle classe d'agents thérapeutiques pour une variété de maladies dont le VIH. Beaucoup de rapports précédents ont montré que les nouvelles stratégies à base RNAi anti-VIH/SIDA thérapeutiques très prometteurs, mais un obstacle majeur à l'application réussie thérapeutiques et la traduction clinique de siRNA est une livraison efficace. En particulier, compte tenu de la sécurité et l'efficacité des traitements à base RNAi, il est hautement souhaitable de développer une approche ciblée intracellulaire livraison de siRNA à des populations spécifiques de cellules ou de tissus. Le VIH-1 protéine gp120, une glycoprotéine de l'enveloppe sur la surface du VIH-1, joue un rôle important dans l'entrée virale dans les cellules CD4. L'interaction de la gp120 et du CD4 qui déclenche le VIH-1 entrée et initie la fusion cellulaire a été validé comme cliniquement pertinente anti-viraux stratégie de découverte de médicaments.

Ici, nous avons d'abord discuter de la sélection et l'identification de la 2'-F modifiés anti-VIH gp120 aptamères d'ARN. En utilisant une méthode SELEX nitrocellulose filtre classique, plusieurs aptamères nouvelle avec une affinité nanomolaire ont été isolés à partir d'un aléatoire 50 bibliothèques nt ARN. Pour réussir à obtenir des espèces lié avec une affinité plus élevée, la rigueur de sélection est soigneusement contrôlée en ajustant les conditions. Les aptamères sélectionnés peuvent se lier spécifiquement et rapidement être internalisés dans les cellules exprimant la protéine d'enveloppe du VIH-1. De plus, les aptamères seul peut neutraliser le VIH-1 infectant. Sur la base des meilleures aptamère A-1, nous créons également un roman à double fonction inhibitrice anti-gp120 aptamère-siRNA chimère dans laquelle les deux l'aptamère et les portions siARN ont une puissante activité anti-VIH. De plus, nous utilisons la gp120 aptamère-siRNA chimères pour un type de cellule spécifique de la livraison de siRNA sur le VIH-1 des cellules infectées. Cette double fonction chimère montre un potentiel considérable pour combiner divers agents acides nucléiques thérapeutiques (aptamère et de siRNA) à supprimer l'infection VIH-1, ce qui rend les chimères aptamère-siRNA attrayants candidats thérapeutiques pour les patients en échec thérapie antirétrovirale hautement active (HAART).

Protocol

1. Préparation de la bibliothèque de l'ARN La banque d'ADN de départ contient 50 nucléotides de séquences aléatoires et a été synthétisé par Integrated DNA Technologies (Cedar Rapids, Iowa). La seule séquence bloqués banque d'ADN oligo est 5'-GGG ATG AGG ACG CGG – N 50 – CAG ACG ACT CCG GCC A – 3 '(81 nt). La région est flanquée par hasard régions constantes, qui comprennent le promoteur T7 pour transcription in vitro et une balise de 3 'pour…

Discussion

Les aptamères sont des acides nucléiques in vitro évolué qui supposent spécifique et stable des formes tridimensionnelles, offrant ainsi très spécifique, obligatoire serré pour 8 molécules ciblées. La faible affinité nanomolaire liaison et la spécificité exquise d'aptamères à leurs cibles en font des outils polyvalents pour le diagnostic, l'imagerie in vivo, et de la thérapeutique 9. Avec l'avènement de la technologie pour aptamère l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Britta Hoehn, Guihua Soleil, Harris Soifer et Lisa Scherer pour les discussions utiles. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et de AI29329 HL07470 attribué à JJR Les réactifs suivants ont été obtenus par la recherche des NIH sida et Référence Reagent Program, Division du sida, du NIAID, NIH: Le CHO-EE et CHO-gp160 cellulaire ligne; l'pNL4-3 Luc vecteur; VIH-1 gp120 du DAIDS BaL, le NIAID.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
MF-Millipore membrane filter Millipore HAWP01300 Pore size 0.45 μm
Swinnex Filter holder Millipore SX0001300 13 mm diameter
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28706 DNA purification
Microcon YM-30 column Millipore 42410 RNA concentration
Bio-spin 30 column Bio-Rad 732-6250 RNA purification
Taq PCR DNA polymerase Sigma-Aldrich D1806  
ThermoScript RT-PCR system Invitrogen 11146-024  
DuraScribe T7 transcription Kit EpiCentre DS010925  
dNTP for PCR Roche 1 581 295  
Ribonucleic acid, transfer from E.coli Sigma-Aldrich R1753 tRNA competitor
HIV-1Ba-L gp120 protein the AIDS Research and Reference Reagent Program 4961 Target protein
Silencer siRNA labeling kit – Cy3 Ambion 1632  
Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) Ambion AM9720  
Chloroform/Isopropanol 24/1 solution Sigma C0549  
Calf intestinal phosphatase (CIP) New England BioLab M0290L  
T4 polynucleotide kinase New England BioLab M0201L  
Glycogen Roche 10 901 393 001 RNA precipitation
Gamma-P32-ATP MP Biomedical 013502002 Radiactivity
40% AccuGel 19:1 National Diagnostics EC-850  
10xTBE National Diagnostics EC-860  
N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) Sigma-Aldrich T9281  
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678  
L-methioine sulfoximine Sigma-Aldrich M5379-250 mg  
RPMI Media 1640 Invitrogen 11835-030  
Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v Invitrogen 25080-094  
Minimum Essential Medium (MEM) (10) Invitrogen 11430-030  
MEM non-essential amino acid (100) Invitrogen 11140-050  
TA cloning kit with pCR 2.1 Invitrogen K2040-01  

References

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Cite This Article
Zhou, J., Li, H., Zhang, J., Piotr, S., Rossi, J. Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery. J. Vis. Exp. (52), e2954, doi:10.3791/2954 (2011).

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