Развитие сотового типа конкретных анти-ВИЧ gp120 аптамеры для доставки миРНК
Summary
Несколько 2'-фтор РНК аптамеры против ВИЧ-1BA-L gp120 с наномоля близость изолированы от библиотеки РНК<em> В пробирке</em> SELEX процедуры. Новый двойной тормозной функции анти-gp120 аптамер-миРНК химера создается и показывает значительные предпосылки для системных анти-ВИЧ-терапии.
Abstract
Глобальная эпидемия ВИЧ-инфекции создало насущную необходимость новых классов антиретровирусных препаратов. Мощные способности малых интерферирующих (SI) РНК для подавления экспрессии дополнительных транскриптов РНК в настоящее время используются в качестве нового класса терапевтических средств для целого ряда заболеваний, включая ВИЧ. Многие предыдущие отчеты показали, что роман RNAi основе Анти-ВИЧ/СПИД терапевтических стратегий широкие перспективы, однако основным препятствием для успешного терапевтического применения и клинических перевод siRNAs является эффективной доставки. Особенно, принимая во внимание безопасность и эффективность RNAi основе терапии, крайне желательно разработать целевые внутриклеточной доставки миРНК подход к конкретной популяции клеток или тканей. ВИЧ-1 gp120 протеин, гликопротеин конверт на поверхности ВИЧ-1, играет важную роль в вирусные вступления в клетки CD4. Взаимодействие gp120 и CD4, который вызывает ВИЧ-1, вход и инициирует слияние клеток была подтверждена как клинически значимые антивирусной стратегии для открытия новых лекарств.
При этом, во-первых, мы обсудим выбор и идентификация 2'-F изменение анти-ВИЧ gp120 аптамеров РНК. Использование обычных нитроцеллюлозных фильтров метод SELEX, несколько новых аптамеры с наномолярных близости были выделены из 50 случайных п РНК библиотеку. Для того чтобы успешно получить вид связан с более высоким сродством, выбор жесткости тщательно контролируется путем изменения условий. Выбранных аптамеры могут специфически связываться и быстро внутренним в клетках, экспрессирующих ВИЧ-1 конверт белка. Кроме того, аптамеры только могут нейтрализовать ВИЧ-1 инфекционности. Основываясь на лучших аптамер-1, мы также создаем новый двойной тормозной функции анти-gp120 аптамер-миРНК химеры, в которых оба аптамер и миРНК части обладают мощным анти-ВИЧ. Кроме того, мы используем gp120 аптамер-миРНК химер для камерного типа конкретной доставки миРНК в ВИЧ-1 инфицированных клеток. Эта двойная функция химера показывает значительный потенциал для объединения различных нуклеиновых кислот терапевтических агентов (аптамер и миРНК) для подавления инфекции ВИЧ-1, что делает аптамер-миРНК химеры привлекательной терапевтической кандидатов для пациентов отсутствии высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ).
Protocol
Discussion
Аптамеры в пробирке развивались нуклеиновых кислот, которые принимают конкретные и устойчивые трехмерные формы, тем самым обеспечивая высокую конкретные, жесткие привязки к целевой молекулы 8. Низкий наномолярных сродство и изысканные специфику аптамеры к цели сделать их ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Бритта Hoehn, Гуйхуа ВС, Харрис Сойфер и Лиза Шерер за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья и AI29329 HL07470 присуждена JJR следующие реагенты были получены через NIH исследований СПИДа и Программа Ссылка реагентов, Отдел СПИДа, NIAID, NIH: СНО-EE и СНО-gp160 ячейки линии; pNL4-3 Люк вектор; ВИЧ-1 БЛ gp120 из DAIDS, NIAID.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| MF-Millipore membrane filter | Millipore | HAWP01300 | Pore size 0.45 μm |
| Swinnex Filter holder | Millipore | SX0001300 | 13 mm diameter |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | DNA purification |
| Microcon YM-30 column | Millipore | 42410 | RNA concentration |
| Bio-spin 30 column | Bio-Rad | 732-6250 | RNA purification |
| Taq PCR DNA polymerase | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR system | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 transcription Kit | EpiCentre | DS010925 | |
| dNTP for PCR | Roche | 1 581 295 | |
| Ribonucleic acid, transfer from E.coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA competitor |
| HIV-1Ba-L gp120 protein | the AIDS Research and Reference Reagent Program | 4961 | Target protein |
| Silencer siRNA labeling kit – Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform/Isopropanol 24/1 solution | Sigma | C0549 | |
| Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England BioLab | M0290L | |
| T4 polynucleotide kinase | New England BioLab | M0201L | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | RNA precipitation |
| Gamma-P32-ATP | MP Biomedical | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:1 | National Diagnostics | EC-850 | |
| 10xTBE | National Diagnostics | EC-860 | |
| N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI Media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (10) | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM non-essential amino acid (100) | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA cloning kit with pCR 2.1 | Invitrogen | K2040-01 |
References
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Robertson, D. L., Joyce, G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature. 344, 467-468 (1990).
- Fitzwater, T., Polisky, B. A SELEX primer. Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).
- Weiss, C. D., White, J. M. Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. J Virol. 67, 7060-706 (1993).
- Vodicka, M. A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses. Virology. 233, 193-198> (1997).
- Zhou, J. Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).
- Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy. Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).
- Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. Aptamer mediated siRNA delivery. Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).
- McNamara, J. O., 2nd, . Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras. Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).
- Dassie, J. P. Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors. Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).
- Zhou, J., Rossi, J. J. The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers. Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).
- Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy. Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).
