I denne artikkelen presenterer vi en enkel, praktisk teknikk for cerebrovaskulære casting som er enkel å utføre og kan utnyttes til bildet den vaskulære tre av den voksne musen hjernen.
Vaskulær bildebehandling er viktig i klinisk diagnostikk og behandling av cerebrovaskulære sykdommer, for eksempel hjerne arteriovenøse misdannelser (BAVMs). Dyremodeller er nødvendig for å studere etiopathology og potensielle terapier for cerebrovaskulære sykdommer. Imaging blodkar i store dyr er relativt enkelt. Imidlertid utvikler fartøy avbildning metoder for murine hjernesykdom modeller ønskelig på grunn av kostnader og tilgjengelighet av genmodifiserte mus linjer. Imaging den murine cerebral vaskulær treet er en utfordring. Hos mennesker og større dyr, gullstandarden for å vurdere angioarchitecture på makrovaskulære (konduktans) nivået er x-ray kateter contrast-baserte angiografi, en metode ikke er egnet for små gnagere.
I denne artikkelen presenterer vi en metode for cerebrovaskulær casting som gir en holdbar skjelett av hele vaskulære sengen, inkludert arterier, vener og kapillærer som kan analyseres ved hjelp av mange different modaliteter. Komplett støping av microvessels av musen cerebrovasculature kan være vanskelig, men er disse utfordringene adressert i denne steg-for-steg protokollen. Gjennom intracardial perfusjon av vaskulære casting materiale, er alle fartøyer av kroppen avgitt. Hjernen kan da tas ut og avklares med organiske løsemidler metyl salicylate. Tredimensjonal avbildning av hjernen blodkar kan visualiseres enkelt og rimelig med enhver konvensjonell lysfelt mikroskop eller dissekere mikroskop. Den støpt cerebrovasculature kan også avbildes og kvantifiseres ved hjelp av mikro-computertomografi (micro-CT) 1. I tillegg, etter å ha blitt fotografert, kan støpt hjernen være innebygd i parafin for histologisk analyse.
Fordelen med denne vaskulær casting metoden i forhold til andre teknikker er dens brede tilpasning til ulike analyseverktøy, herunder lysfelt mikroskopisk analyse, CT-skanning på grunn av røntgentett karakterteristic av materialet, samt histologiske og immunhistokjemiske analyser. Denne effektiv bruk av vev kan spare dyr bruk og redusere kostnadene. Vi har nylig demonstrert anvendelsen av denne metoden for å visualisere uregelmessig blodkar i en mus modell av voksen BAVM på et mikroskopisk nivå 2, og gi ytterligere bilder av misdannede fartøy fotografert av mikro-CT scan. Selv om denne metoden har ulemper og kan ikke være ideelt for alle typer analyser, er det en enkel, praktisk teknikk som lett kan læres og er mye brukt til vaskulær støping av blodårer i hele kroppen.
Vi rapporterer her en metode for støping av voksen mus cerebrovasculature som kan avbildes med ulike modaliteter. Anvendelse av denne metoden for sykdommen modell BAVM muliggjør 3D-analyse av uregelmessig fartøy. Potensielle fremtidige studier inkludere kvantifisering av mikro-CT-bilder, histologiske analyser av vev, og diagnostisering av vaskulær sykdom progresjon.
Vanlige problemene og forslag
Komplett perfusjon av hjernen blodkar er ikke alltid oppnås. Å ha nok trykk til å nå distale blodkar uten rupturing venstre atrium eller aorta er en utfordring. For å overvinne dette, gjelder konsekvent trykket på ca 100mmHg. Også justere nålposisjon å sikre hensiktsmessig strøm av casting agenten inn i aorta. Det er viktig at carotis ikke er begrenset slik at casting agent kan nå hjernen fartøy. Kritiske prosedyrer som korrelerer med forbedret små fartøy perfusjon er: (1) skikkelig clearing av blodet fra blodkar, (2) filtrering av casting agent; og (3) nål plassering under støping agenten injeksjon. Forsiktighet bør utvises for å unngå injeksjon av casting agenten inn i venstre atrium og lunge. Andre forskere har lykkes perfused mus 3 og rotte 4 cerebrovasculature uten å bruke ekstra prosedyrer. Manuell analyse av Microfil perfused fartøy kontrafarget med hemotoxylin viste 93% fartøy lumen perfusjon 5. Alltid forkaste eller helt ren noen verktøy som kommer i kontakt med casting agenten som det vil polymerisere raskt, og verktøyene kan ikke brukes for flere fag. Avklaring av de omkringliggende musen hjernevevet kan være utfordrende. Etter nedsenking i metyl salicylate, kan vevet fortsatt vises ugjennomsiktig, noe som gjør skipet bildebehandling vanskelig. Sikre riktig dehydrering og avklaring bør løse dette problemet. Plassering av hjernevev på en rocker i alkohol og metyl eralicylate behandling kan bedre vev avklaring.
Ulemper av teknikken
Begrensningene med denne teknikken er: (1) det er nødvendig å injisere casting agenten løsningen umiddelbart etter blande det som det blir tykkere raskt etter katalysatoren er lagt, (2) støping agenten fyller store konduktans fartøyer lett, men det gjør ikke pålitelig fylle mindre skip, som for eksempel arterioler (motstand fartøy) og kapillærer (næringsrik fartøy) og (3) det er ikke den beste røntgentett kontrasten for mikro-CT bildebehandling, selv om noen grupper foretrekker Microfil for mikro-CT bildebehandling 1,6. Men etter forslagene foreslått ovenfor, inkludert riktig nål plassering, fartøyets posisjon og perfusjon press, kan fullføre støping av mindre fartøy oppnås. Tilpasningsevne til ulike analyseverktøy som gjør denne agenten et verdifullt verktøy for å analysere cerebrovaskulære struktur, inkludert arterielle og venøse sirkulasjon, med ulikeperspektiver.
Anvendelser av teknikken
Fordelen med denne metoden er dens bred anvendelse potensial. Kastet fyller alle fartøyer, herunder arterier, vener og kapillærer i alle vev i kroppen, så vaskulære strukturer i flere organer av ulike arter kan analyseres. Tidligere har andre grupper benyttet denne perfusjon for stor 7 og små åtte fartøy i human, monkey 9, sauer 10, rotte 4,11,12 og mus 3,13. Vi viser nå tegn til å bruke denne teknikken i å analysere strukturen av microvessels i musen hjernen, både friske og syke tilstander 2. I tillegg er det Microfil løsninger med ulike viskositeter tilgjengelig for perfuse skip av forskjellige størrelser og forskjellige farger for å forbedre visualiseringen av fartøyene i ulike organer. For eksempel kan rødt være lett visualiseres i den bleke hjernen parenchyma, og gule kontraster godt medmørk rød myokard. Videre, ettersom materialet er røntgentett, kan vasculature bli fotografert med micro-CT-skanning for å oppnå en 3D roterbart bilde. Vevet kan også brukes for parafin seksjoner og histologiske analyser etter å ha blitt avbildet.
Konklusjon
Vi viser her en protokoll for å gjøre en vaskulær kastet av blodårene i den voksne musen hjernen, som kan tilpasses ved hjelp av en rekke analyse teknikker for å studere den morfologiske strukturen i cerebrovasculature. Vi har også gitt bevis for anvendelsen av denne metoden til en modell av BAVM sykdommen staten, representert ved forstørret, uregelmessig formet fartøy som shunt blod fra arteriell til venøse opplag. Det er en rekke av vaskulær støpemetoder tilgjengelig. Den enkel protokoll vi leverer her for en vaskulær kastet kan brukes som et verktøy for å undersøke blodkar av den voksne mus hjernen ved hjelp av ulike bildediagnostikk.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Voltaire Gungab for hjelp med manuskriptet forberedelser. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra: National Institutes of Health (T32 GM008440 til EJ Walker, R01 NS27713 til WL Young, P01 NS44155 til WL Young og H. Su) og R21 NS070153 til H. Su, og den amerikanske Heart Association (AHA 10GRNT3130004 til H. Su).
Name | Company | Catalogue number | Notes |
Microfil | FlowTech, Inc. | MV130 | 4 month shelf life |
Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |