Kwantificeren niveaus van HIV-1 RNA in het plasma en de volgorde single HIV-1 genoom van individuen met een viral load onder de detectielimiet (50-75 kopieën / ml) is moeilijk. Hier beschrijven we hoe te winnen en te kwantificeren plasma virale RNA met behulp van een real-time PCR-test die een betrouwbare maatregelen HIV-1 RNA beneden tot 0,3 kopieën / ml en hoe virale genomen versterken door enkele genoom, van monsters met een zeer lage viral load.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Versterken virale genen en het kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-1 geïnfecteerde personen met een viral load onder de detectielimiet door standaard assays (minder dan 50 tot 75 kopieën / ml) is nodig om inzicht te krijgen op virale dynamiek en virus gastheer interacties bij patiënten die natuurlijk de controle van de infectie en degenen die op antiretrovirale combinatietherapie (CART).
Hier beschrijven we hoe de virale genomen versterken door enkele genoom (de SGS-protocol) 13, 19 en hoe nauwkeurig kwantificeren HIV-1 RNA in patiënten met een lage virale belasting (de single-copy assay (SCA)-protocol) 12, 20.
De single-kopie assay is een real-time PCR-test met de gevoeligheid afhankelijk van het volume van het plasma wordt getest. Als een enkel virus genoom wordt gedetecteerd in 7 ml plasma, dan is het RNA-kopie-aantal is naar verluidt 0,3 kopieën / ml. De test heeft een interne controle van het testen voor de efficiëntie van RNA-extractie, en controles voor mogelijke versterking van DNA of vervuiling. Monsters van patiënten worden gemeten in drievoud.
De single-genoom sequencing assay (SGS), die nu op grote schaal gebruikt en wordt beschouwd als niet-arbeidsintensief 3, 7, 12, 14, 15, is een beperkende verdunning assay, waarbij eindpunt verdunde cDNA product is verspreid over een 96-wells plaat. Volgens een Poisson-verdeling, wanneer er minder dan 1 / 3 van de putten te geven product, is er een 80% kans van het PCR-product wordt resultante van versterking van een enkele cDNA-molecuul. SGS heeft het voordeel ten opzichte van het klonen van het niet worden onderworpen aan resampling en niet wordt vertekend door PCR-geïntroduceerde recombinatie 19. Echter, de versterking succes van SCA en SGS zijn afhankelijk van primer design. Beide testen zijn ontwikkeld voor HIV-1 subtype B, maar kan worden aangepast voor andere subtypen en andere regio's van het genoom door het veranderen van primers, probes, en normen.
Protocol
1. Extractie van RNA uit grote hoeveelheden plasma
Een overzicht van de enkel exemplaar assay (SCA) en de interne genoom sequencen (SGS)-protocol zijn opgenomen in de figuren 1 en 2.
- Voor het verkrijgen van 7 ml plasma, spin ongeveer 14 ml bloed opgevangen in 15 ml EDTA (niet heparine) collectie buizen op 2.600 xg gedurende 15 minuten zonder remmen. Pipet plasma (en zorg ervoor dat de buffy coat laag te voorkomen) in 15 ml buizen.
- Als RNA wordt onttrokken voor de enkele kopie assay (SCA), spike het plasma met 30.000 exemplaren van de Rous sarcomavirus interne virion controle (RCA). De RCA virus is voor gebruik bereid ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
HIV-1 geïnfecteerde personen op antiretrovirale combinatietherapie (CART) of die van nature de controle van de infectie hebben een zeer lage virale belasting, meestal rond een kopie per ml plasma 4, 11, 12, 17, 18. Viral load bij patiënten met een natuurlijke beheersing, vaak schommelen rond een individuele set punt 1, 2, 17. De gevoeligheid van de testen hierin beschreven is sterk afhankelijk van de input volume van het plasma. Over het algemeen hebben we gewerkt met 7 ml plasma, maar positieve re.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de patiënten die deelnamen aan de vele studies van HIV-1 te erkennen.
JMC was een Research Professor van de American Cancer Society met de steun van de FM-Kirby Foundation.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogus nummer | Reacties |
| Random hexameren (500 ug / ml) | Promega | C118A | |
| Taqman buffer A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U / ul) | Promega | N211B | |
| RT enzym (200 U / ul) | Strategene | 600107-51 | |
| Amplitaq Gold DNA polymerase | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| Amplitaq 10XGold PCR-buffer II | Applied Biosystems | 4311814 | wordt geleverd met het enzym |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | wordt geleverd met het enzym |
| 1 M Tris-HCl-buffer, pH 8,0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Superscript III reverse transcriptase enzym, 200 U / ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Superscript III 10X buffer | Invitrogen | wordt geleverd met het enzym | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | wordt geleverd met het enzym | |
| Platinum Taq DNA-polymerase High Fidelity 5 U / ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X High Fidelity PCR-buffer | Invitrogen | 11304-102 | wordt geleverd met het enzym |
| Proteïnase-K 20 mg / ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidiniumthiocyanaat oplossing 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Glycogeen 20 mg / ml | Roche | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Ethanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Moleculair-biologische kwaliteit water | Gibco / Invitrogen | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol per stuk) | Bioline | BIO-39025 |
| Naam van de Euipment | Vennootschap | Catalogus nummer | Reacties |
|---|---|---|---|
| Gemakkelijk Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) | Seaton Wetenschappelijke | 6041 | |
| Witte Delrin kronen | Seaton Wetenschappelijke | 4020 | Caps voor de Easy Seal Tubes |
| Buizenrek voor Optiseal Bell-Top Buizen, 8,9 ml | Beckman | 361642 | |
| Hex driver ½ inc opening | Seaton Wetenschappelijke | 4013 | |
| dop verwijderen tupe | Seaton Wetenschappelijke | 4014 | |
| 5 ml serologische pipetten | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | een | ||
| 15 ml Transfer pipetten | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5,8 ml Dispossable overdracht pipetten, fijne punt | VWR | 14670-329 | |
| 15 ml centrifugebuizen | Valk | ||
| 1 ml centrifugebuizen | een | ||
| Tris buffer Saline tabletten | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrifuge en rotor | Sorval | 90SE en T-1270 | |
| 96-well PCR-platen | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 ml Reagens reservoir | Costar | 4870 | |
| MICROAMP optische 96-well plaat reactie | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Optische plaat dekt | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MICROAMP Optische Compressie Pad | Applied Biosystems | 4312639 | |
| MicrosealEen film | Biorad | MSA-5001 | |
| 2 ml centrifugebuizen | Een | ||
| 1% agarose gels (E-gel, Invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
EDTA Collectie buizen elk merk
Referenties
- Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
- Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
