Verstärkung und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-infizierten Personen mit Viruslast unter der Nachweisgrenze von Standard Clinical Assays

Summary

Die Quantifizierung der HIV-1 RNA im Plasma und Sequenzierung einzelner HIV-1 Genome von Individuen mit einer Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze (50-75 Kopien / ml) ist schwierig. Hier beschreiben wir, wie zu extrahieren und zu quantifizieren, Plasma-Virus-RNA mit Hilfe eines Echtzeit-PCR-Assay, der zuverlässig misst HIV-1 RNA bis zu 0,3 Kopien / ml und wie man virale Genome von einzelnen Genomsequenzierung verstärken, von Proben mit sehr niedrigen Viruslast.

Abstract

Amplifikation viraler Gene und Quantifizierung von HIV-1 RNA in HIV-1 infizierten Patienten mit einer Viruslast unterhalb der Nachweisgrenze von Standard-Tests (unter 50-75 Kopien / ml) ist notwendig, um einen Einblick zu viralen Dynamik und Virus Wirt-Interaktionen zu gewinnen bei Patienten, die natürlich Kontrolle der Infektion und diejenigen, die auf einer antiretroviralen Kombinationstherapie (cART) sind.

Hier beschreiben wir, wie man virale Genome von einzelnen Genoms (die SGS-Protokoll) ^{13, 19} und wie genau quantifizieren HIV-1 RNA bei Patienten mit niedrigen Viruslast (die Single-Copy-Test (SCA)-Protokoll) ^{12, 20} zu verstärken.

Die Single-copy-Assay ist ein real-time PCR-Assay mit Empfindlichkeit in Abhängigkeit vom Volumen des Plasmas untersucht. Wenn ein einzelner Virus-Genom in 7 ml Plasma erkannt wird, dann ist die RNA-Kopienzahl gemeldet zu 0,3 Kopien / ml liegen. Der Test hat ein internes Kontrollsystem Tests für die Effizienz der RNA-Extraktion und Steuerungen für möglich Amplifikation aus DNA oder Verunreinigung. Patientenproben sind in dreifacher Ausfertigung gemessen.

Die Single-Genom-Sequenzierung Assay (SGS), mittlerweile weit verbreitet und als nicht arbeitsintensiv ^{3, 7, 12, 14, 15,} ist ein limitierender Verdünnung Assay, in dem Endpunkt verdünnten cDNA Produkt über einen 96-Loch verteilt Platte. Laut einer Poisson-Verteilung, wenn weniger als 1 / 3 der Brunnen Produkt geben, gibt es eine 80% ige Chance, das PCR-Produkt wird resultierenden Verstärkung von einer einzigen cDNA-Molekül. SGS hat den Vorteil, über das Klonen von nicht zu Resampling unterzogen und nicht durch PCR eingeführt Rekombination ¹⁹ vorgespannt. Allerdings hängen die Verstärkung Erfolg von SCA und SGS auf Primer-Design. Beide Tests wurden für HIV-1 Subtyp B entwickelt, kann aber für andere Subtypen und anderen Regionen des Genoms, indem Primer, Sonden und Standards angepasst werden.

Protocol

1. Extraktion von RNA aus große Mengen an Plasma-

Eine Übersicht über die einzelne Kopie Assay (SCA) und die einzigen Genoms (SGS)-Protokoll sind in den Abbildungen 1 und 2 vorgesehen.

1. Um 7 ml Plasma, Spin ca. 14 ml Blut in 15 ml EDTA (nicht Heparin) Sammelröhrchen bei 2.600 xg für 15 Minuten ohne zu bremsen. Pipette Plasma (achten Sie darauf, die Buffy-Coat-Schicht zu vermeiden) in 15 ml Tuben.
2. Wenn RNA wird für die einzelne Kopie Assay (SCA), spike das Plasma mit 30.000 Kopien des Rous Sarcoma Virus internen Virion-Steuerung (RCAS) extrahiert. Die RCAS Virus ist vor der Durchführung SCA wie zuvor beschrieben (20) vo....

Discussion

HIV-1 infizierten Personen auf einer antiretroviralen Kombinationstherapie behandelt (cART) oder die natürlich kontrollieren die Infektion haben eine sehr niedrige Viruslast, typischerweise etwa 1 Exemplar pro ml Plasma ^{4, 11, 12, 17, 18.} Viruslast bei Patienten mit natürlichen Kontrolle, oft um einen individuellen Sollwert ^{1, 2, 17} schwanken. Die Empfindlichkeit des hier beschriebenen Tests ist stark abhängig von der Eingabe Volumen von Plasma. Generell haben wir mit 7 ml Plasma gearbeitet, aber p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Zufällige Hexameren (500 ug / ml)	Promega	C118A
Taqman Puffer A	Applied Biosystems	4304441
RNAsin (40 U / ul)	Promega	N211B
RT-Enzym (200 U / ul)	Strategene	600107-51
AmpliTaq Gold DNA-Polymerase	Applied Biosystems	4311814	6-pack
Amplitaq 10XGold PCR-Puffer II	Applied Biosystems	4311814	kommt mit dem Enzym
Magnesiumcloride 25 mM	Applied Biosystems	4311814	kommt mit dem Enzym
1M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 5 mM	Invitrogen	AM9855G
Superscript III Enzym reverse Transkriptase, 200 U / ul	Invitrogen	18080-044
Superscript III 10X-Puffer	Invitrogen		kommt mit dem Enzym
100 mM DTT	Invitrogen		kommt mit dem Enzym
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity 5 U / ul	Invitrogen	11304-102
10x High Fidelity PCR Buffer	Invitrogen	11304-102	kommt mit dem Enzym
Proteinase-K 20 mg / ml	Ambion	2546
Guanidiniumthiocyanat Lösung 6M	FlukaBiochemica	50983
Glykogen 20 mg / ml	Roche	10901393001
Isopropanol	Sigma-Aldrich	19516
Ethanol 70%	Sigma-Aldrich	E702-3
Molecular-Wasser	Gibco / Invitrogen	10977-015
dNTPs (25 mmol pro Stück)	Bioline	BIO-39025

Name des Euipment	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Einfache Seal Zentrifugenröhrchen (16x73mm)	Seaton Scientific	6041
Weiß Delrin Kronen	Seaton Scientific	4020	Caps für den Easy Seal Tubes
Tube Rack für Optiseal Bell-Top Tubes, 8,9 ml	Beckman	361642
Hex-Treiber ½ inc Eröffnung	Seaton Scientific	4013
Kappe Entfernung tupe	Seaton Scientific	4014
5 ml serologischen Pipetten	Costar	4051
Pipetboy	alle
15 ml Transferpipetten	ISC Bioexpress	P-5005-7
5,8 ml Dispossable Transferpipetten, feine Spitze	VWR	14670-329
15 ml Zentrifugenröhrchen	Falke
1 ml Zentrifugenröhrchen	alle
Tris-Puffer Saline Tabletten	Sigma-Aldrich	T5030-100TAB
Ultrazentrifuge und Rotor	Sorval	90SE und T-1270
96-well PCR-Platten	Biorad	HSS-9601
50 ml Reagenz-Reservoir	Costar	4870
Microamp optischen 96-Well-Reaktionsplatte	Applied Biosystems	N801-0560
Optische Platte deckt	Applied Biosystems	4333183
MicroAmp Optical Compression Pad	Applied Biosystems	4312639
MicrosealEin Film	Biorad	MSA-5001
2 ml Zentrifugenröhrchen	Alle
1% igen Agarosegelen (E-Gel, Invitrogen)	Invitrogen	G-7008 bis 01
E-base (Invitrogen)	Invitrogen	EB-M03