Summary

Isolamento de Ilhotas Humanos de pacientes parcialmente pancreatectomizado

Published: July 30, 2011
doi:

Summary

O fornecimento de diabéticos tipo 2 ilhotas para pesquisa é insuficiente. Aqui nós compartilhamos nosso protocolo para isolar ilhotas de pacientes submetidos à pancreatectomia parcial. Esta abordagem representa um local único para a obtenção de ilhotas de diabéticos tipo 2 e clinicamente combinado não-diabéticos em número adequado para estudos básicos e clínicos.

Abstract

Investigações sobre a patogênese da diabetes tipo 2 e ilhotas de Langerhans um mau funcionamento tem sido prejudicada pela disponibilidade limitada de ilhotas diabéticos tipo 2 de 2 doadores de órgãos. Aqui nós compartilhamos nosso protocolo para isolar ilhotas pancreáticas humanas a partir de tecido obtido a partir de diabéticos tipo 2 e não diabéticos que foram submetidos a pancreatectomia parcial devido a doenças pancreáticas diferentes (tumores pancreáticos benignos ou malignos, pancreatite crônica, e ducto biliar comum ou tumores duodenal) . Todos os pacientes envolvidos deram o seu consentimento a este estudo, que também havia sido aprovado pelo Comitê de Ética local. Os espécimes cirúrgicos foram imediatamente entregues ao patologista que selecionou tecido pancreático macia e saudável aparecendo para o isolamento de ilhotas, mantendo o tecido danificado para fins de diagnóstico. Descobrimos que para isolar mais de 1.000 ilhotas, tivemos que começar com pelo menos 2 g de tecido pancreático. Também essencial para o nosso protocolo foi visivelmente a distender o tecido ao injetar a mídia contendo enzima e, posteriormente, mediu-lo para ajudar a digestão, aumentando a área de superfície.

Alargar a aplicabilidade do nosso protocolo para incluir o caso ocasional em que uma grande quantidade (> 15g) de tecido pancreático humano está disponível, foi utilizado uma câmara de Ricordi (50 ml) para digerir o tecido. Durante a digestão, que balançou a câmara manualmente Ricordi 3 em uma intensidade que variou de amostra de acordo com seu nível de fibrose tecidual. A descontínua gradiente Ficoll foi então usada para separar as ilhotas do tecido acinar. Notamos que o tecido pellet deve ser pequeno o suficiente para ser homogeneamente ressuspenso em meio Ficoll com uma densidade de 1,125 g / ml. Após o isolamento, as ilhotas cultivadas que sob condições de estresse livre (sem agitação ou rotação) com 5% de CO 2 a 37 ° C durante pelo menos 48 h, a fim de facilitar a sua recuperação funcional. Aplicação generalizada do nosso protocolo e seu aperfeiçoamento futuro poderia permitir a colheita oportuna de grandes quantidades de ilhotas humanas de diabéticos e clinicamente combinado não-diabéticos, com grande avanço da diabetes tipo de pesquisa 2.

Protocol

1. Coleta de tecido pancreático na sala de cirurgia O cirurgião realiza uma ressecção parcial do pâncreas. Depois de colocar a amostra de pâncreas em uma caixa de gelo, entregá-lo imediatamente para o patologista. 2. Seleção de tecidos para isolamento de ilhotas O patologista seleciona tecido que parece macia e saudável, mantendo o tecido danificado para fins de diagnóstico. Tecido fibrótico e espécimes oferecendo menos de 2 g de tecido utilizável são excluídos do isolamento de ilhotas. Mergulhe o tecido pancreático em solução Euro Collins e entregar no gelo para o laboratório. 3. Isolamento de ilhotas humanas Pese o tecido pancreático, em seguida, coloque-o em um prato de 10 cm. Coloque 150 ml RPMI mídia em um balão de 500 ml. Em um frasco de 250 ml, preparar a solução de enzimas digestivas, combinando RPMI 130 ml de mídia com 100 mg / ml DNase e 20 ml de 5mg/ml RI Liberase. Draw 10 ml desta solução para uma seringa para injetar o tecido pancreático. Injetar a solução de enzimas digestivas no tecido pancreático, com o objetivo de distender-lo de forma homogênea. Se este for impedido pela fibrose, a digestão, provavelmente, falhar. Em seguida, mediu o tecido em ~ 4 mm 3 peças no gelo. 4. Circuito digestão humana pâncreas Monte o circuito da digestão, como mostrado na Figura 1. O sentido do fluxo na câmara Ricordi é no fundo e sair no topo da câmara. Adicionar a solução de enzima digestiva restantes para o balão de 500 ml até um volume total de 300 ml e coloque um termômetro. Transferir o tecido pancreático para a câmara, insira o mesh (diâmetro dos poros: 600 mm) e três Marbles nitreto de silício (diâmetro: 15 mm), perto da câmara e começar a bomba com o fluxo fixado em 140 ml / min. Quando a temperatura do circuito atinge 37 ° C, iniciar a cronometragem e, periodicamente, colher amostras para determinar quando parar a digestão. Coloração com ditizona (2 mg / ml) permite a visualização microscópica de ilhotas no tecido digerido 4. Uma vez que os ilhéus são separados a partir do tecido acinar circundante, rapidamente parar a digestão, colocando a bobina de aquecimento no gelo e adicionando 200 ml de mídia lavagem a frio (900 ml RPMI 1640 com 5,5 mM de glicose e FBS 10%) para o circuito. Recolher a solução de ilhotas em 250 ml tubos cônicos, uma vez que sai do tubo de amostra. Continue até que o circuito está vazio. Figura 1. O circuito de digestão humana pâncreas O circuito digestão humana pâncreas inclui uma câmara de Ricordi contendo mesh (diâmetro dos poros: 600 mm) e três bolas de gude nitreto de silício (diâmetro: 15 mm). Saída da câmara é movida para o balão de coleta de tecido pela bomba peristáltica (140 ml / min). Setas indicam a direção do fluxo. Uma temperatura ideal para a digestão enzimática é mantida por imersão da bobina de aquecimento em banho-maria a 37 ° C. 5. Lavagem pós-digestão Centrifugar a 250 ml tubos cônicos contendo a solução de ilhotas a 1000 rpm, 4 ° C por 5 min. Desprezar o sobrenadante, ressuspender o sedimento ilhota na lavagem de mídia (900 ml RPMI 1640 com 5,5 mM de glicose e FBS 10%) e distribuí-lo em frações iguais a 50 tubos de ml. (Opcional:. Distribuir em tubos cônicos adicionais para melhorar a lavagem) Centrifugar a 1000 rpm, 4 ° C por 5 min. Elimine o sobrenadante e gentilmente afrouxar pellets por agitação manual. 6. Purificação em um gradiente de Ficoll Ressuspender o sedimento com Ficoll media a uma densidade de 1,125 g / ml, pH 7,4 e lentamente overlay alíquotas de 10 ml de Ficoll media com densidades de 1,080, 1,060 e 1,037 g / ml. Centrifugar os gradientes de Ficoll a 2400 rpm, 4 ° C por 20 min. 7. Islet Recolha e Cultura Após a centrifugação, componentes do tecido diferentes podem ser distinguidos pela sua partição no gradiente. Descartar a camada superior composta de gordura e tecido conjuntivo. Cuidadosamente a colheita da primeira camada de agregados ilhota na interfase 1,037-1,060 g / ml. Esta camada contém as ilhotas mais puro isolado. Coletar fracções para isolamento eficiente. Recolher a fracção de segundo, menos pura de agregados ilhota na interfase 1,060-1,080 g / ml. Diluir o gradiente de Ficoll, adicionando media de lavagem (900 ml RPMI 1640 com 5,5 mM de glicose e FBS 10%) a cada tubo cônico até um volume total de 50 ml. Centrifugar a 1000 rpm, 4 ° C por 5 min. Desprezar o sobrenadante por sucção. Tenha cuidado como o pellet pode estar solto devido ao gradiente de Ficoll. Lave o wi pelletsª lavagem de mídia (900ml RPMI 1640 com 5,5 mM de glicose e FBS 10%) e centrifugar a 1000 rpm, 4 ° C por 5 min. Repita usando meios de cultura ilhéu Volte a suspender as ilhotas em meios de cultura e colocá-los na incubadora com 5% de CO 2 a 37 ° C por 24-48 horas antes do processamento.

Representative Results

Nosso protocolo renderam uma média de ~ 500 ilhotas por grama de tecido pancreático, embora este muito variadas entre as preparações em grande parte devido a diferenças na fibrose e atividade da colagenase. Conseguimos> pureza das ilhotas de 90% através da coloração pela primeira vez com Ditizona durante o processamento de tecidos, então handpicking-los 24 horas depois do isolamento. Para determinar a qualidade das ilhotas purificadas, testamos para 25 mM de glicose estimulada a secreção de insulina em condições estáticas, por 2 horas. Encontramos a secreção de insulina comparável à de ilhotas obtidas de ECIT isolamento de ilhotas e centros de transplantação. Como ilhotas isoladas de pancreata parcialmente pancreatectomizado não são destinadas para transplante de ilhotas, a avaliação da IEQ total foi de que não foi considerada um fator crítico. Importante, o nosso método nos permitiu isolar ilhotas para estudos funcionais de 25 pacientes parcial pancreatectomizado entre 2005 e 2008 5. Estas ilhas foram analisadas para glicose estimulada a secreção de insulina e expressão de proteínas específicas borrando ocidental e imuno-histoquímica. Ilhotas isoladas de pancreata parcialmente pancreatecomized também poderia ser usado para comparar genes e de perfis de proteínas de expressão, aparência ultra-estruturais e respostas funcionais de ilhotas não-diabéticos e diabéticos. Porque há mais pacientes submetidos à pancreatectomia parcial do que há doadores de órgãos, o nosso protocolo poderia permitir que amostras suficientes e dados a serem coletados para análise estatística robusta.

Discussion

Usando nosso protocolo, as ilhotas humanas podem ser isoladas de tecido pancreático coletados a partir de uma pancreatectomia parcial. O sucesso deste protocolo baseia-se no cuidado durante alguns pontos críticos. Para preservar a viabilidade das células beta, é essencial que a amostra seja transportada rapidamente sobre o gelo para o laboratório. Além disso, a duração da digestão do tecido deve ser otimizado empiricamente de acordo com o grau de fibrose tecidual ea atividade enzimática da mídia. Isso também é verdadeiro para o grau de força mecânica aplicada manualmente à câmara Ricordi. Assim, para obter um rendimento bom ilhéu, o protocolo é melhor executada por um cientista dedicado ou assistente técnico. Fracasso inicial é a norma, a menos que a equipe já está experiente em isolamento de ilhotas.

Existem diferenças fundamentais entre o nosso protocolo de isolamento de ilhotas eo método padrão de isolamento de ilhotas humanas: 1) Apesar de usarmos tecido pancreático submetido a várias horas de isquemia durante o procedimento cirúrgico, ele é imediatamente transformado em site. Isto está em contraste com pancreata explantado de doadores em morte encefálica para o pâncreas / transplante de ilhotas, que permanecem isquêmica por várias horas durante a alocação e entrega à instalação de isolamento de ilhotas. 2) Nós colagenase injetar diretamente no tecido pancreático, enquanto que o protocolo padrão é infundir-lo para o ducto pancreático. 3) Nós separar as ilhotas utilizando um gradiente de Ficoll descontínua em vez de recolher as ilhotas de um gradiente de Ficoll contínua usando um processador de células COBE.

Nos casos em que a peça cirúrgica é muito fibrótica ou escassos para isolar um número adequado de ilhotas, o tecido ainda podem ser recuperados por laser microdissecção de captura (LCM) 10. Isso permite que dados de expressão gênica a ser recuperado a partir de praticamente todas as amostras, mesmo que o isolamento das ilhotas falhar ou o rendimento é muito baixo. Infelizmente, LCM não produz células vivas para estudos funcionais e sua quantidade é normalmente insuficiente para análise proteômica. Assim, usando LCM em paralelo com nosso protocolo de digestão da colagenase para recuperar as ilhotas podem ser a maneira mais eficaz de processo de peças cirúrgicas.

Ao coletar tecidos para isolamento de ilhotas de pancreatectomies parcial, é importante examinar cuidadosamente a história clínica do paciente e estado metabólico. Um paciente parcialmente pancreatectomizado poderiam ser afetados por diabetes tipo 3c, ou seja, diabetes secundário ao distúrbio do pâncreas levando a cirurgia 6. Entre os 43 pacientes participantes que se submeteram a esta cirurgia em nosso serviço em 2010, 32 eram não-diabéticas, 5 foram afetadas pelo diabetes tipo 2 e 6 apresentavam diabetes tipo 3c. Estes dados concordam com estudos anteriores que apontam para o metabolismo da glicose prejudicada e diabetes em uma fração considerável de pacientes que sofrem de câncer de pâncreas ou pancreatite crônica 6. Consideramos diabetes ser de origem primária se foi diagnosticado pelo menos um ano antes do início dos sintomas principais da cirurgia pancreática 7. Os níveis de anticorpos contra ilhotas auto-antígenos também devem ser medidos para avaliar uma origem auto-imune potencial do diabetes 8. Porque um paciente submetido a pancreatectomia poderia sofrer de diabetes não diagnosticada ou ser intolerantes à glicose, todos os pacientes não-diabéticos deve ser dado um teste de tolerância oral à glicose antes da pancreatectomia 9.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Queremos agradecer aos nossos muitos colegas que prestaram ajuda, conselhos e críticas de entrada em várias fases do projeto. Produção deste artigo vídeo foi apoiado com fundos do Ministério Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) para o Centro Alemão de Pesquisa do Diabetes (DZD, http://www.dzd-ev.de ), IMIDIA ( http://www . imidia.org ) eo Hospital Universitário de Carl Gustav Carus, da Universidade de Tecnologia de Dresden. A pesquisa que levou a estes resultados beneficiaram de financiamento do Programa da Comunidade Europeia Quadro (FP7/2007-2013) para a Iniciativa de Medicamentos Inovadores no âmbito da convenção de subvenção n ° 115005.

Materials

Name Company Catalogue number
Equipment
1 ml serological pipette (CELLSTAR) greiner bio-one 604181
10 ml serological pipette (CELLSTAR) greiner bio-one 607180
25 ml serological pipette (CELLSTAR) greiner bio-one 760180
10 ml Syringe BD (Becton, Dickinson and Company) 300912
50 ml Syringe BD (Becton, Dickinson and Company) 300865
5 ml Syringe BD (Becton, Dickinson and Company) 309050
18 G 1,1/2 Needle Microlance 3 BD (Becton, Dickinson and Company) 304622
27 Gx1/2 Needle Braun 4658300
27 Gx3/4 Needle Microlance 3 BD (Becton, Dickinson and Company) 302200
3 cm cell culture dish 2×2 mm grid Nunc 174926
20 cm Tissue culture dish BD (Becton, Dickinson and Company) 353003
6 cm Easy grip petri dish BD (Becton, Dickinson and Company) 351016
150 ml storage bottle Corning Incorporated 431175
250 ml Erlenmeyer flasks Schott Duran 21 217 36
500 ml Erlenmeyer flasks Schott Duran 21 217 44
250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube Corning Incorporated 430776
50 ml Falcon conical tube BD (Becton, Dickinson and Company) 352070
260 ml Easyflask Non-treated Nunc 156800
Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm) Millipore SLGV033RB
Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume) Corning Incorporated 431118
Densitometer (Densito 30PX) LWE37463 Mettler Toledo 51324450
Fast PES Filter Unit 0,2 μm Nalgene 569-0020
Heating Coil BioRep Technologies Inc HC-02
Multifuge 4 KS-R Heraeus 75015680
Pump Typ PD5206 Heidolph 523-52060-00-2
Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter) BioRep Technologies Inc. Model 50-U-01, Serial 0503-001
Preparation Stand BioRep Technologies Inc. 50-PS-01
O-Rings BioRep Technologies Inc. OR-50-U-01
Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9) BioRep Technologies Inc. SN-01
Silicon Tubing Tygon R 3603 8,0X4,0 mm
Surgical forceps Braun BD168R
Surgical scissors (Aesculap) Braun BC273R
Water bath OLS 200 Grant OLS 200
Reagents
Collagenase -> Liberase RI (100 mg) Roche 11815032001
D(+)-Glucose Merck 1.08337.1000
Dimethylsulfoxide (DMSO) Merck 1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone (DTZ) Sigma Aldrich D5130
DNase I (100 mg) Roche 10104159001
Dulbeccos 1xPBS PAA Laboratories H15-002
Electrolytsolution E154 Serumwerk 00509
Fetal Bovine Serum (FBS) PAA Laboratories A15-101
Ficoll 400 Sigma Aldrich F9378
Foetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270-106
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES) Roth 9105.3
NaOH, 5 M clinical pharmacy, hospital
Penicillin/Streptomycin (100x) PAA Laboratories P11-010
Pipettaid (EXPRESS) BD (Becton, Dickinson and Company) 357591
Potassiumchlorid Fluka 60132
Potassiumdihydrogenphospate anhydrous JT Baker 0241
Potassiummonohydrogenphosphate JT Baker 3246-01
RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine Gibco 11879-020
RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine PAA Laboratories E15-840
Sodiumhydrogencarbonat Merck 1.06329.0500

Media and Solutions

Dithizone Solution

  • Dissolve 100 mg DTZ in 10 ml DMSO and dilute in 40 ml PBS
  • Sterile filter the solution (0.22 μm)

Enzyme Solution

  • Dissolve 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 media (without supplements)
  • Dissolve 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 media (without supplements)
  • Sterile filter the solution (0.22 μm) and keep the enzyme on ice

Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)

  • Dissolve 100 ml FBS (heat inactivated)
  • Add 450 ml RPMI 1640 (no glucose)
  • Add 450 ml RPMI 1640 (11 mM glucose)
  • Sterile filter the solution (0.22 μm)

Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)

  • Dissolve 10 ml 1M HEPES (pH 7.4)
  • Add 50 ml FBS
  • Add 5 ml penicillin/streptomycin (100x)
  • Add 2.75 ml 1 M Glucose Solution
  • Add 432.25 ml RPMI 1640 (no glucose)
  • Sterile filter the solution (0.22 μm)

Euro Collins Solution

  • 4,083 g potassium hydrogenphosphate
  • 70,0 g glucose
  • 2,237 g potassium chloride
  • 14,80 g potassium monohydrogenphosphate
  • 1,680 g sodium hydrogencarbonate
  • 40 ml electrolyte solution (E 154)
  • pH 7.4
  • Add distilled water up to 2000 ml
  • Sterile filter the solution (0.22 μm)

Ficoll Stock Solution

  • Add 1000 ml of Euro Collins Solution to 500 g Ficoll
  • Add 8.94 g HEPES
  • Stir overnight until Ficoll is solved
  • pH 7.4
  • Measure the density

Ficoll Gradients

  • Calculate the amount of FBS, Euro Collins Solution and Ficoll Stock Solution according to the density
  • Combine the 3 solutions and measure the density with a densitometer
  • Add Euro Collins Solution or Ficoll Stock Solution until the density is adjusted
  • Sterile filter the solution (0.22 μm) and store at 4°C

References

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Cite This Article
Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., Baretton, G. B., Solimena, M., Saeger, H. D. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962, doi:10.3791/2962 (2011).

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