عزلة الإنسان الفشوت من المرضى مستأصل البنكرياس جزئيا

Summary

المعروض من الجزر من النوع 2 السكري للبحوث غير كافية. هنا نحن لدينا حصة بروتوكول لعزل الجزر من المرضى الذين يخضعون لاستئصال البنكرياس جزئيا. هذا النهج يمثل فرصة فريدة للحصول على الجزر من السكري من النوع 2 وغير المتطابقة سريريا السكري الموضوعات بأعداد كافية للدراسات الأساسية والسريرية.

Abstract

وقد أعاق التحقيقات في إمراض السكري من النوع 2 والجزر من خلل انجرهانز ¹ من محدودية الجزر السكري نوع 2 من ² المتبرعين بالأعضاء. هنا نحن لدينا حصة بروتوكول لعزل الجزر من نسيج البنكرياس الإنسان الحصول عليها من مرضى السكري من النوع 2 السكري وغير المرضى الذين خضعوا لاستئصال البنكرياس جزئيا بسبب أمراض مختلفة البنكرياس (أورام حميدة أو خبيثة البنكرياس ، التهاب البنكرياس المزمن ، والقناة الصفراوية المشتركة أو الأورام الاثني عشر) . أعطى جميع المرضى المشاركين موافقتهم على هذه الدراسة ، التي لديها أيضا تمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاق المحلية. على الفور تم تسليم العينات الجراحية إلى الطبيب الشرعي الذي اختار ناعمة وصحية أنسجة البنكرياس تظهر للعزلة الجزيرة ، الإبقاء على الأنسجة التالفة لأغراض التشخيص. كنا قد وجدنا أن لعزل أكثر من 1000 جزيرة ، لتبدأ على الأقل 2 غرام من نسيج البنكرياس. من الضروري أيضا أن بروتوكول جهدنا ليتمدد بشكل ملحوظ عند حقن الأنسجة وسائل الإعلام التي تحتوي على انزيم واللحم المفروم لاحقا للمساعدة على الهضم من خلال زيادة مساحة السطح.

لتوسيع نطاق تطبيق بروتوكول لتشمل حالة عرضية فيه كمية كبيرة (> 15G) من نسيج البنكرياس البشرية المتاحة ، واستخدمنا غرفة Ricordi (50 مل) لهضم الأنسجة. خلال عملية الهضم ، ونحن هزت يدويا غرفة Ricordi ³ في شدة أن تتفاوت من العينة وفقا لمستواها من تليف الأنسجة. واستخدمت بعد ذلك التدرج Ficoll discontinous لفصل الأنسجة من الجزر عنيبية. لاحظنا أن بيليه الأنسجة يجب أن تكون صغيرة بما يكفي لتكون معلق في وسط متجانس Ficoll مع كثافة 1.125 غرام / مليلتر. بعد عزلة ، ونحن المثقفين الجزر في ظل ظروف خالية من الإجهاد (لم تهتز أو التناوب) مع 5 ٪ CO ₂ عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة على الأقل من أجل تسهيل تعافيهم وظيفية. ويمكن تطبيق البروتوكول على نطاق واسع لدينا وتحسينها في المستقبل تمكين الحصاد في الوقت المناسب لكميات كبيرة من الجزر البشرية من مرض السكري والمتطابقة سريريا الموضوعات غير مصاب بالسكري ، والمضي قدما إلى حد كبير البحوث داء السكري من النوع 2.

Protocol

1. نسيج البنكرياس جمع في غرفة العمليات الجراح بإجراء استئصال جزئي للبنكرياس. بعد وضع العينة في البنكرياس مربع على الجليد ، وتسليمها على الفور إلى الطبيب الشرعي. 2. اختيار الأنسجة لجزيرة العزلة يختار الطبيب الشرعي الذي يظهر نسيج ناعم وصحي ، والإبقاء على الأنسجة التالفة لأغراض التشخيص. يتم استبعاد الأنسجة تليفي وتقديم العينات أقل من 2 غرام من الأنسجة يمكن استخدامها من عزلة الجزيرة. تزج في نسيج البنكرياس الحل كولينز وتسليم اليورو على الجليد إلى المختبر. 3. عزلة الجزر الإنسان وزن النسيج البنكرياس ، ثم ضع عليه في صحن 10 سم. وضع 150 مل RPMI وسائل الاعلام في قارورة 500 مل. في قارورة 250 مل ، وإعداد الحل الانزيم الهضمي من خلال الجمع بين 130 مل مع وسائل الاعلام RPMI الدناز ملغ / 100 مل و 20 مل من RI Liberase 5mg/ml. تعادل 10 مل من هذا المحلول إلى حقنة لحقن الأنسجة البنكرياس. حقن محلول الإنزيم الهضمي في أنسجة البنكرياس ، وتهدف إلى أن يتمدد متجانس. إذا تم ذلك عن طريق منع تليف ، سوف تفشل عملية الهضم احتمالا. المقبل ، في نسيج اللحم المفروم 4 ملم ~ 3 قطع على الجليد. 4. الإنسان الدائرة البنكرياس الهضم تجميع الدوائر الهضم كما هو مبين في الشكل 1. اتجاه تدفق في الغرفة Ricordi في أسفل والخروج في الجزء العلوي من القاعة. إضافة الانزيم الهضمي المتبقية حل للقارورة 500 مل تصل إلى إجمالي حجم 300 مل وإدراج مقياس الحرارة. نقل أنسجة البنكرياس في الغرفة ، تضاف شبكة (قطر المسام : 600 ميكرون) وثلاثة من الرخام نتريد السيليكون (القطر : 15 ملم) ، على مقربة من القاعة وبدء ضخ مع تدفق وضعت في 140 مل / دقيقة. عند درجة حرارة تصل إلى الدائرة 37 درجة مئوية ، وبدء التوقيت واتخاذ عينات دورية لتحديد متى توقف عملية الهضم. تلطيخ مع dithizone (2 ملغ / مل) تسمح برؤية مجهرية من الجزر داخل النسيج هضمها 4. مرة واحدة يتم فصل الجزر من الأنسجة المحيطة عنيبية ، سرعان ما توقف عملية الهضم عن طريق وضع ملف التسخين على الجليد ، وإضافة 200 مل من وسائل الإعلام يغسل الباردة (900 مل RPMI 1640 مع الجلوكوز ملي 5.5 و FBS 10 ٪) إلى الحلبة. جمع الحل جزيرة في أنابيب مخروطية 250 مل لأنه يخرج من أنبوب العينة. تستمر حتى حلبة فارغة. الشكل 1. عملية الهضم والبنكرياس الإنسان الدائرة هضم البنكرياس الإنسان الدائرة تضم غرفة تحتوي على شبكة Ricordi (قطر المسام : 600 ميكرون) ، وثلاث قطع الرخام نيتريد السيليكون (القطر : 15 ملم). والدافع تدفق من غرفة إلى الأنسجة قارورة جمع بواسطة مضخة تمعجية (140 مل / دقيقة). الأسهم تشير إلى اتجاه التدفق. المحافظة على درجة الحرارة المثلى لعملية الهضم الأنزيمي بغمر ملف التسخين في حمام ماء C ° 37. 5. الغسيل بعد الهضم أجهزة الطرد المركزي ال 250 مل تحتوي على أنابيب مخروطية الحل جزيرة في 1000 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف ، resuspend الكرية الجزيرة في وسائل الإعلام يغسل (900 مل RPMI 1640 مع الجلوكوز ملي 5.5 و FBS 10 ٪) وتوزيعه في أجزاء متساوية للأنابيب مخروطية 50 مل. (اختياري : توزيع في أنابيب مخروطية إضافية لتحسين الغسيل) جهاز طرد مركزي في 1000 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وتخفيف بلطف الكريات التي تهز اليدوي. 6. تنقية على التدرج Ficoll Resuspend الكرية مع وسائل الاعلام Ficoll في كثافة 1.125 غ / مل ، ودرجة الحموضة 7.4 و تراكب ببطء aliquots 10 مل من وسائل الاعلام Ficoll مع كثافة 1.060 ، 1.080 و 1.037 غرام / مليلتر. الطرد المركزي التدرجات Ficoll في 2400 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. 7. جزيرة جمع والثقافة بعد الطرد المركزي ، يمكن التمييز بين مكونات النسيج مختلفة عن طريق التقسيم في التدرج. تجاهل الطبقة العليا التي تتألف من النسيج الضام والدهون. الحصاد بعناية الطبقة الأولى من المجاميع جزيرة في الطور البيني غ / مل 1،037-1،060. هذه الطبقة تحتوي على معظم الجزر المعزولة نقية. جمع الكسور بشكل منفصل عن العزلة الفعالة. جمع الثانية ، كسر أقل نقية من المجاميع جزيرة في الطور البيني غ / مل 1،060-1،080. تمييع التدرج Ficoll بإضافة وسائل الإعلام يغسل (900 مل RPMI 1640 مع الجلوكوز ملي 5.5 و FBS 10 ٪) لكل أنبوب مخروطي يصل إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 مل. الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف عن طريق الشفط. استخدام الرعاية مثل بيليه قد يكون راجعا إلى فضفاضة التدرج Ficoll. غسل واي الكرياتال يغسل وسائل الإعلام (900ml RPMI 1640 مع الجلوكوز ملي 5.5 و FBS 10 ٪) ، وأجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تكرار استخدام وسائط الثقافة الجزيرة Resuspend الجزر في وسائل الإعلام والثقافة ، ووضعها في الحاضنة مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2 في 37 ل24-48 ساعة قبل مواصلة تجهيز درجة مئوية.

Representative Results

أسفرت بروتوكول لدينا في المتوسط ​​من الجزر 500 ~ لكل غرام من النسيج البنكرياس ، على الرغم من تفاوت كبير بين هذه الاستعدادات إلى حد كبير بسبب الاختلافات في والنشاط كولاجيناز التليف. حققنا> جزيرة نقاء 90 ٪ بحلول الأول مع تلوين Dithizone أثناء معالجة الأنسجة ، ثم انتقاء منها بعد 24 ساعة من العزلة. لتحديد نوعية الجزر منقى ، نحن اختبار لمدة 25 ملي الجلوكوز حفز افراز الانسولين في ظل ظروف ثابتة لمدة 2 ساعة. تم العثور على افراز الانسولين يمكن أن تقارن من الجزر التي تم الحصول عليها من العزلة جزيرة ECIT ومراكز الزرع. لأنه ليس المقصود من الجزر المعزولة بنكرياسات مستأصل البنكرياس جزئيا عن زرع جزيرة ، وتقييم مجموع IEQ لا يعتبر عاملا حاسما. الأهم من ذلك ، تمكين لدينا وسيلة لنا لعزل الجزر للدراسات الفنية من المرضى 25 مستأصل البنكرياس الجزئي بين عامي 2005 و 5 عام 2008. وقد تم تحليل هذه الجزر لالجلوكوز حفز افراز الانسولين ومحددة بروتين تعبير بواسطة النشاف الغربية والمناعية. ويمكن أيضا الجزر المعزولة من بنكرياسات pancreatecomized جزئيا استخدامها للمقارنة بين الجينات والبروتينات ملامح التعبير ، والمظهر التركيبية الوظيفية والاستجابات من الجزر غير المصابين بالبول السكري ومرض السكري. لأن هناك المزيد من المرضى الذين يخضعون لاستئصال البنكرياس جزئيا من هناك المتبرعين ، ويمكن لدينا بروتوكول يسمح جمع عينات كافية والبيانات للتحليل الإحصائي قوية.

Discussion

باستخدام بروتوكول لدينا ، ويمكن الإنسان من الجزر المعزولة أنسجة البنكرياس التي جمعت من استئصال البنكرياس الجزئي. نجاح هذا البروتوكول يعتمد على الرعاية التي اتخذت خلال نقطة حرجة قليلة. للحفاظ على سلامة خلايا بيتا ، فمن الضروري أن يتم نقل العينات بسرعة على الجليد إلى المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون الأمثل مدة الهضم الأنسجة تجريبيا وفقا لدرجة تليف الأنسجة والنشاط الأنزيمي من وسائل الإعلام. هذا ينطبق أيضا على درجة من القوة الميكانيكية المطبقة يدويا إلى غرفة Ricordi. وبالتالي الحصول على محصول جيد جزيرة ، يتم تنفيذ بروتوكول أفضل من قبل عالم مخصصة أو مساعد تقني. الفشل الأولي هو القاعدة ما لم يتم بالفعل فريق من ذوي الخبرة في عزلة الجزيرة.

هناك اختلافات رئيسية بين جزيرة لدينا بروتوكول العزلة والعزلة مستوى جزيرة البشرية الأسلوب : 1) على الرغم من أننا استخدام أنسجة البنكرياس تعرض لعدة ساعات من نقص التروية أثناء إجراء الجراحة ، ويتم معالجتها على الفور في الموقع. هذا هو على النقيض من بنكرياسات explanted من الدماغ ميت المانحين لالبنكرياس / جزيرة الزرع الدماغية التي تبقى لعدة ساعات خلال تخصيص وتسليمها للمنشأة جزيرة العزلة. 2) نحن كولاجيناز حقن مباشرة في أنسجة البنكرياس ، في حين أن البروتوكول هو معيار لضخه في القناة البنكرياسية. 3) ونحن منفصلة الجزر باستخدام التدرج Ficoll متقطع بدلا من جمع الجزر من الانحدار المستمر Ficoll باستخدام معالج الخلية كوبي.

في الحالات التي تكون فيها عينة جراحية نادرة جدا أو تليفي لعزل عدد كاف من الجزر ، لا يزال الأنسجة التي يمكن استرجاع microdissection التقاط الليزر (LCM) ^10. هذا يسمح استرداد البيانات من عينة التعبير الجيني تقريبا ، حتى إذا فشل أو العزلة جزيرة العائد منخفض جدا. للأسف ، LCM لا تنتج الخلايا الحية للدراسات الفنية وقيمتها غير كافية عادة لتحليل البروتين. وبالتالي ، قد تستخدم LCM بالتوازي مع شركائنا كولاجيناز بروتوكول الهضم لاسترداد الجزر تكون الطريقة الأكثر فعالية لمعالجة العينات الجراحية.

عند جمع الأنسجة لعزلة الجزيرة من pancreatectomies جزئية ، من المهم أن تدرس بعناية التاريخ المريض السريرية والأيض الدولة. وقد يتأثر المريض مستأصل البنكرياس جزئيا حسب نوع 3C السكري ، أي مرض السكري الثانوي إلى اضطراب البنكرياس مما يؤدي إلى عملية جراحية ^6. وكان من بين المرضى الذين خضعوا ل43 المشاركة في هذه الجراحة ادارتنا في عام 2010 ، 32 منهم كانوا غير مصابين بالبول السكري ، تتأثر 5 من مرض السكري من النوع 2 و 6 من النوع 3C السكري. هذه البيانات تتفق مع دراسات سابقة تشير إلى اختلال عملية التمثيل الغذائي ومرض السكري الجلوكوز في جزء كبير من المرضى الذين يعانون من سرطان البنكرياس أو التهاب البنكرياس المزمن ^6. اعتبرنا أن مرض السكري المنشأ الأساسي إذا تم تشخيص ما لا يقل عن عام واحد قبل ظهور الأعراض التي تؤدي إلى جراحة البنكرياس ^7. وينبغي أيضا على مستويات الأجسام المضادة ضد autoantigens جزيرة تقاس لتقييم الأصل الذاتية المحتملة للمرض السكري ^8. لأن المريض يمكن أن يمر استئصال البنكرياس يعانون من مرض السكري دون تشخيص أو أن يكون الجلوكوز التعصب ، ينبغي إعطاء جميع المرضى غير المصابين بالبول السكري an تحمل الغلوكوز الفموي اختبار مسبق لاستئصال البنكرياس ^9.

Materials

Name	Company	Catalogue number
Equipment
1 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	604181
10 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	607180
25 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	760180
10 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	300912
50 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	300865
5 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	309050
18 G 1,1/2 Needle Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	304622
27 Gx1/2 Needle	Braun	4658300
27 Gx3/4 Needle Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	302200
3 cm cell culture dish 2×2 mm grid	Nunc	174926
20 cm Tissue culture dish	BD (Becton, Dickinson and Company)	353003
6 cm Easy grip petri dish	BD (Becton, Dickinson and Company)	351016
150 ml storage bottle	Corning Incorporated	431175
250 ml Erlenmeyer flasks	Schott Duran	21 217 36
500 ml Erlenmeyer flasks	Schott Duran	21 217 44
250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube	Corning Incorporated	430776
50 ml Falcon conical tube	BD (Becton, Dickinson and Company)	352070
260 ml Easyflask Non-treated	Nunc	156800
Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm)	Millipore	SLGV033RB
Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume)	Corning Incorporated	431118
Densitometer (Densito 30PX) LWE37463	Mettler Toledo	51324450
Fast PES Filter Unit 0,2 μm	Nalgene	569-0020
Heating Coil	BioRep Technologies Inc	HC-02
Multifuge 4 KS-R	Heraeus	75015680
Pump Typ PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter)	BioRep Technologies Inc.	Model 50-U-01, Serial 0503-001
Preparation Stand	BioRep Technologies Inc.	50-PS-01
O-Rings	BioRep Technologies Inc.	OR-50-U-01
Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9)	BioRep Technologies Inc.	SN-01
Silicon Tubing	Tygon	R 3603 8,0X4,0 mm
Surgical forceps	Braun	BD168R
Surgical scissors (Aesculap)	Braun	BC273R
Water bath OLS 200	Grant	OLS 200
Reagents
Collagenase -> Liberase RI (100 mg)	Roche	11815032001
D(+)-Glucose	Merck	1.08337.1000
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Merck	1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone (DTZ)	Sigma Aldrich	D5130
DNase I (100 mg)	Roche	10104159001
Dulbeccos 1xPBS	PAA Laboratories	H15-002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00509
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAA Laboratories	A15-101
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F9378
Foetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES)	Roth	9105.3
NaOH, 5 M	clinical pharmacy, hospital	–
Penicillin/Streptomycin (100x)	PAA Laboratories	P11-010
Pipettaid (EXPRESS)	BD (Becton, Dickinson and Company)	357591
Potassiumchlorid	Fluka	60132
Potassiumdihydrogenphospate anhydrous	JT Baker	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JT Baker	3246-01
RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine	Gibco	11879-020
RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine	PAA Laboratories	E15-840
Sodiumhydrogencarbonat	Merck	1.06329.0500

Media and Solutions

Dithizone Solution

• Dissolve 100 mg DTZ in 10 ml DMSO and dilute in 40 ml PBS
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Enzyme Solution

• Dissolve 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 media (without supplements)
• Dissolve 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 media (without supplements)
• Sterile filter the solution (0.22 μm) and keep the enzyme on ice

Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)

• Dissolve 100 ml FBS (heat inactivated)
• Add 450 ml RPMI 1640 (no glucose)
• Add 450 ml RPMI 1640 (11 mM glucose)
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)

• Dissolve 10 ml 1M HEPES (pH 7.4)
• Add 50 ml FBS
• Add 5 ml penicillin/streptomycin (100x)
• Add 2.75 ml 1 M Glucose Solution
• Add 432.25 ml RPMI 1640 (no glucose)
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Euro Collins Solution

• 4,083 g potassium hydrogenphosphate
• 70,0 g glucose
• 2,237 g potassium chloride
• 14,80 g potassium monohydrogenphosphate
• 1,680 g sodium hydrogencarbonate
• 40 ml electrolyte solution (E 154)
• pH 7.4
• Add distilled water up to 2000 ml
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Ficoll Stock Solution

• Add 1000 ml of Euro Collins Solution to 500 g Ficoll
• Add 8.94 g HEPES
• Stir overnight until Ficoll is solved
• pH 7.4
• Measure the density

Ficoll Gradients

• Calculate the amount of FBS, Euro Collins Solution and Ficoll Stock Solution according to the density
• Combine the 3 solutions and measure the density with a densitometer
• Add Euro Collins Solution or Ficoll Stock Solution until the density is adjusted
• Sterile filter the solution (0.22 μm) and store at 4°C