הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

Summary

אספקת 2 איים סוכרת סוג למחקר אינה מספיקה. כאן אנו חולקים פרוטוקול שלנו לבידוד איים של חולים שעברו pancreatectomy חלקית. גישה זו מהווה מקום מפגש ייחודי לקבלת איים של סוכרת מסוג 2 שאינם מתאימים קלינית סוכרת הנושאים במספרים נאותה מחקרים בסיסיים וקליניים.

Abstract

חקירות בפתוגנזה של סוכרת מסוג 2 איי לנגרהנס תקלה ¹ כבר הקשו על ידי זמינות מוגבלת של איים סוכרת מסוג 2 איברים מתורמים ^2. כאן אנו חולקים פרוטוקול שלנו לבידוד איים מ רקמת לבלב אנושיים המתקבל סוכרת מסוג 2 שאינם סוכרתיים המטופלים שעברו pancreatectomy חלקית עקב מחלות שונות הלבלב (גידולים שפירים או ממאירים הלבלב, דלקת לבלב כרונית, ואת צינור המרה המשותף או התריסריון גידולים) . כל החולים המעורבים נתנו הסכמתם במחקר זה, אשר גם אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. דגימות כירורגית נמסרו מיד הפתולוג שבחרו רך ובריא רקמת לבלב המופיעים לבידוד איון, שמירה על רקמות פגועות למטרות אבחון. מצאנו כי על מנת לבודד יותר מ -1,000 איים, היינו צריכים להתחיל עם לפחות 2 גרם של רקמת לבלב. חיוני גם בפרוטוקול שלנו היתה בעליל להתנפח כאשר הרקמה הזרקת האנזים המכילים התקשורת ובהמשך לקצץ בו כדי לסייע לעיכול על ידי הגדלת שטח הפנים.

כדי להרחיב את הישימות של פרוטוקול שלנו לכלול את התיק מדי פעם שבה כמות גדולה (> 15g) של רקמת לבלב אנושיים זמין, השתמשנו קאמרית Ricordi (50 מ"ל) לעכל את הרקמה. במהלך העיכול, אנו ידני הרעיד את חדר Ricordi ³ בעוצמה כי מגוונות על ידי דגימה לפי רמתו של סיסטיק רקמות. שיפוע Ficoll discontinous שימש אז להפריד בין איים מרקמות acinar. אנו לציין כי רקמת גלולה צריך להיות קטן מספיק כדי להיות resuspended homogenously עם צפיפות של 1.125 גרם / מ"ל ​​במדיום Ficoll. לאחר בידוד, אנו תרבותי איים בתנאי הלחץ בחינם (לא רועד או סיבוב) עם 5% CO ₂ על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפחות על מנת לאפשר התאוששות פונקציונלי שלהם. יישום נרחב של פרוטוקול שלנו לשיפור עתידה יכול לאפשר את הקטיף בזמן של כמויות גדולות של איים האדם מן סוכרת קלינית מתאימים שאינם סוכרתיים נושאים, מאוד לקידום מחקר הסוכרת מסוג 2.

Protocol

1. רקמת לבלב אוסף בחדר הניתוח המנתח מבצע כריתה חלקית של הלבלב. לאחר שהניח את הדגימה הלבלב בקופסה על הקרח, להעביר אותו מיד אל הפתולוג. 2. רקמות מבחר לבידוד איון הפתולוג בוחר רקמות שמופיע רך ובריא, שמירה על רקמות פגועות למטרות אבחון. דגימות רקמה Fibrotic מציע פחות מ -2 גרם של רקמה שמיש מודרים מהבידוד איון. לטבול את רקמת הלבלב פתרון קולינס אירו ולספק על הקרח למעבדה. 3. בידוד של איים אדם לשקול את רקמת לבלב, ואז למקם אותה לתוך צלחת 10 ס"מ. שימי 150 מ"ל RPMI התקשורת בקבוק 500 מ"ל. בכל בקבוק 250 מ"ל, להכין את הפתרון אנזים העיכול על ידי שילוב של 130 מ"ל RPMI התקשורת עם DNase 100 מ"ג / מ"ל ​​ו – 20 מ"ל של RI Liberase 5mg/ml. צייר 10 מ"ל של פתרון זה לתוך מזרק להזריק את רקמת לבלב. להזריק את הפתרון אנזים העיכול לרקמת הלבלב, במטרה להתנפח זה הומוגנית. אם זה מונע על ידי פיברוזיס, עיכול צפוי להיכשל. בשלב הבא, לקצץ את הרקמה לתוך מ"מ 4 ~ 3 חתיכות על הקרח. 4. הלבלב האנושי העיכול מעגל להרכיב את מעגל העיכול כפי שמוצג באיור 1. כיוון הזרימה בתא Ricordi נמצא בתחתית ומחוץ בחלק העליון של החדר. הוספת האנזים הנותרים העיכול פתרון בקבוק 500 מ"ל עד נפח כולל של 300 מ"ל ולהוסיף מדחום. מעבירים את רקמת לבלב לתוך החדר, להכניס את רשת (קוטר הנקבוביות: 600 מיקרומטר) ושלושה סיליקון ניטריד גולות (קוטר: 15 מ"מ), לסגור את החדר ולהתחיל את המשאבה עם הזרם נקבע על 140 מ"ל / דקה. כאשר הטמפרטורה של המעגל מגיע 37 ° C, להתחיל העיתוי מעת לעת לקחת דגימות כדי לקבוע מתי להפסיק את העיכול. מכתים עם dithizone (2 מ"ג / מ"ל) מאפשר להדמיה מיקרוסקופית של איים בתוך הרקמה מתעכל 4. לאחר איים מופרדים acinar הרקמה שמסביב, במהירות להפסיק את מערכת העיכול על ידי הנחת סליל חימום על הקרח והוספת 200 מ"ל של התקשורת לשטוף קר (900 מ"ל RPMI 1640 עם גלוקוז 5.5 מ"מ ו 10% FBS) למעגל. איסוף הפתרון איון ב 250 מ"ל צינורות חרוטי כפי שהיא באה מתוך הצינור המדגם. המשך עד מעגל ריק. באיור 1. המעגל האנושי עיכול הלבלב מעגל אנושי עיכול הלבלב כולל תא Ricordi המכיל רשת (קוטר הנקבוביות: 600 מיקרומטר) ושלושה סיליקון ניטריד גולות (קוטר: 15 מ"מ). יצוא מהאולם הוא מונע את הבקבוק אוסף רקמות על ידי המשאבה peristaltic (140 mL / min). החצים מצביעים על כיוון הזרימה. הטמפרטורה האופטימלית עיכול אנזימטי מתוחזק על ידי טבילה סליל חימום אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. 5. כביסה לאחר עיכול צנטריפוגה 250 צינורות חרוטי מ"ל המכיל את פתרון איון ב 1000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בטל supernatant, resuspend גלולה איון בכביסה התקשורת (900 מ"ל RPMI 1640 עם גלוקוז 5.5 מ"מ ו 10% FBS) ולהפיץ אותו שברים שווה 50 מ"ל צינורות חרוטי. (אופציונאלי:. הפץ לתוך צינורות חרוטי נוספים כדי לשפר את הכביסה) צנטריפוגה ב 1000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. בטל supernatant בעדינות לשחרר כדורי ידי ניעור ידניות. 6. טיהור על שיפוע Ficoll Resuspend גלולה עם Ficoll המדיה צפיפות של 1.125 גרם / מ"ל, pH 7.4 לאט כיסוי aliquots 10 מ"ל של התקשורת Ficoll עם צפיפות של 1.080, 1.060 ו – 1.037 גרם / מ"ל. צנטריפוגה הדרגתיים Ficoll ב 2400 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. 7. איילט אוסף ותרבות לאחר צנטריפוגה, מרכיבים רקמות שונות ניתן להבחין על ידי מחיצות שלהם שיפוע. מחק את השכבה העליונה המורכבת של רקמת שומן ועל החיבור. בזהירות מסיק את השכבה הראשונה של אגרגטים איון בכל שלבי הביניים גרם / מ"ל ​​1.037-1.060. שכבה זו מכילה את איים מבודדים הטהורה ביותר. איסוף שברים בנפרד עבור בידוד יעיל. אסוף את שבריר השנייה, פחות טהור של אגרגטים איון בכל שלבי הביניים גרם / מ"ל ​​1.060-1.080. לדלל את שיפוע Ficoll ידי הוספת אמצעי התקשורת לשטוף (900 מ"ל RPMI 1640 עם גלוקוז 5.5 מ"מ ו 10% FBS) על כל צינור חרוטי עד נפח כולל של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 1000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בטל supernatant ידי יניקה. השתמש טיפול כמו גלולה עשוי להיות רופף בשל השיפוע Ficoll. שטפו את wi כדוריה לשטוף מדיה (900ml RPMI 1640 עם גלוקוז 5.5 מ"מ FBS 10%) צנטריפוגות ב 1000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חזור על תרבות התקשורת באמצעות איון Resuspend איים בתקשורת תרבות למקם אותם בחממה עם 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות לפני עיבוד נוסף.

Representative Results

Our protocol yielded an average of ~500 islets per gram of pancreatic tissue, although this greatly varied between preparations due largely to differences in fibrosis and collagenase activity. We achieved > 90% islet purity by first staining with Dithizone during tissue processing, then handpicking them 24 hours after isolation. To determine the quality of the purified islets, we tested for 25 mM glucose-stimulated insulin secretion under static conditions for 2 hours. We found insulin secretion comparable to that of islets obtained from ECIT islet isolation and transplantation centers. As islets isolated from partially pancreatectomized pancreata are not meant for islet transplantation, assessment of the total IEQ was not considered to be a critical factor. Importantly, our method enabled us to isolate islets for functional studies from 25 partial pancreatectomized patients between 2005 and 20085. These islets were analyzed for glucose-stimulated insulin secretion and specific protein expression by western blotting and immunohistochemistry. Islets isolated from partially pancreatecomized pancreata could also be used to compare gene and protein expression profiles, ultrastructural appearance and functional responses of non-diabetic and diabetic islets. Because there are more patients undergoing partial pancreatectomy than there are organ donors, our protocol could allow enough samples and data to be collected for robust statistical analysis.

Discussion

באמצעות פרוטוקול שלנו, איים אדם יכול להיות מבודד רקמת לבלב שנאספו pancreatectomy חלקי. ההצלחה של פרוטוקול זה מסתמך על הטיפול נלקח במהלך כמה נקודות קריטיות. כדי לשמר את הכדאיות תא בטא, זה חיוני כי את הדגימה להיות מועבר במהירות על הקרח למעבדה. בנוסף, משך הזמן של עיכול רקמות חייב להיות מותאם באופן אמפירי לפי כיתה של סיסטיק הרקמה ואת הפעילות האנזימטית של התקשורת. זה נכון גם לגבי מידת כוח מכני להחיל באופן ידני את תא Ricordi. לכן כדי להשיג תשואה טובה איון, הפרוטוקול מבוצע על ידי מיטב מדען ייעודי או עוזר טכני. הכישלון הראשוני הוא הנורמה, אלא אם כן צוות מנוסה כבר בבידוד איון.

ישנם הבדלים מרכזיים בין פרוטוקול שלנו איון הבידוד והבידוד תקן אנושי איון השיטה: 1) למרות שאנו משתמשים רקמת לבלב נתון כמה שעות של איסכמיה במהלך ההליך הכירורגי, הוא מעובד באופן מיידי באתר. זה בניגוד pancreata explanted מ מוות מוחי תורמים עבור הלבלב / איון השתלה, אשר נשארים איסכמי במשך כמה שעות במהלך הקצאת משלוח למתקן בידוד איון. 2) אנו collagenase להזריק ישירות לתוך רקמות הלבלב, בעוד פרוטוקול הסטנדרטי הוא להחדיר אותו לתוך צינור הלבלב. 3) יש להפריד בין איים באמצעות שיפוע Ficoll רציפה במקום איסוף איים של צבע Ficoll רציפה תוך שימוש במעבד תא COBE.

במקרים בהם את הדגימה כירורגית fibrotic מדי או מועט לבידוד מספר מספיק של איים, רקמה ניתן עדיין לאחזר באמצעות microdissection ללכוד לייזר (LCM) ^10. זה מאפשר ביטוי נתונים גנטי כדי להיות התאושש הדגימה כמעט בכל, אפילו אם נכשל או בידוד איון התשואה היא נמוכה מאוד. למרבה הצער, LCM אינו מייצר תאים חיים ללימודי תפקודית כמות שלהם אינה מספיקה בדרך כלל לניתוח proteomic. כך, באמצעות LCM במקביל פרוטוקול collagenase העיכול שלנו כדי לאחזר את האיונים עשויה להיות הדרך היעילה ביותר דגימות תהליך כירורגי.

כאשר איסוף רקמה לבידוד איון מ pancreatectomies חלקית, חשוב לבחון היטב ההיסטוריה הקלינית של המטופל ואת מצב מטבולי. המטופל pancreatectomized חלקית עשויים להיות מושפעים על ידי סוג 3c סוכרת, סוכרת כלומר משני להפרעה הלבלב מוביל לניתוח ^6. בקרב 43 חולים המשתתפים שעברו את הניתוח הזה במחלקה שלנו בשנת 2010, 32 היו ללא סוכרת, 5 הושפעו סוכרת מסוג 2 ו 6 סבלו מסוכרת מסוג 3c. נתונים אלה מסכימים עם מחקרים קודמים מצביע על חילוף החומרים של הגלוקוז לקויי סוכרת חלק ניכר של חולים הסובלים מסרטן הלבלב או דלקת לבלב כרונית ^6. שקלנו סוכרת להיות המוצא העיקרית, אם היא אובחנה לפחות שנה לפני הופעת התסמינים מובילים ניתוח לבלב ^7. רמות של נוגדנים נגד איון autoantigens צריך להיות גם נמדד להעריך ממוצא אוטואימוניות הפוטנציאל של סוכרת ^8. בגלל מטופל עובר pancreatectomy יכול סובלים מסוכרת או להיות מאובחן גלוקוז סובלנית, לא כל החולים בסוכרת יש לתת גלוקוז דרך הפה סובלנות בדיקה לפני pancreatectomy ^9.

Materials

Name	Company	Catalogue number
Equipment
1 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	604181
10 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	607180
25 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	760180
10 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	300912
50 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	300865
5 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	309050
18 G 1,1/2 Needle Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	304622
27 Gx1/2 Needle	Braun	4658300
27 Gx3/4 Needle Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	302200
3 cm cell culture dish 2×2 mm grid	Nunc	174926
20 cm Tissue culture dish	BD (Becton, Dickinson and Company)	353003
6 cm Easy grip petri dish	BD (Becton, Dickinson and Company)	351016
150 ml storage bottle	Corning Incorporated	431175
250 ml Erlenmeyer flasks	Schott Duran	21 217 36
500 ml Erlenmeyer flasks	Schott Duran	21 217 44
250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube	Corning Incorporated	430776
50 ml Falcon conical tube	BD (Becton, Dickinson and Company)	352070
260 ml Easyflask Non-treated	Nunc	156800
Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm)	Millipore	SLGV033RB
Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume)	Corning Incorporated	431118
Densitometer (Densito 30PX) LWE37463	Mettler Toledo	51324450
Fast PES Filter Unit 0,2 μm	Nalgene	569-0020
Heating Coil	BioRep Technologies Inc	HC-02
Multifuge 4 KS-R	Heraeus	75015680
Pump Typ PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter)	BioRep Technologies Inc.	Model 50-U-01, Serial 0503-001
Preparation Stand	BioRep Technologies Inc.	50-PS-01
O-Rings	BioRep Technologies Inc.	OR-50-U-01
Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9)	BioRep Technologies Inc.	SN-01
Silicon Tubing	Tygon	R 3603 8,0X4,0 mm
Surgical forceps	Braun	BD168R
Surgical scissors (Aesculap)	Braun	BC273R
Water bath OLS 200	Grant	OLS 200
Reagents
Collagenase -> Liberase RI (100 mg)	Roche	11815032001
D(+)-Glucose	Merck	1.08337.1000
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Merck	1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone (DTZ)	Sigma Aldrich	D5130
DNase I (100 mg)	Roche	10104159001
Dulbeccos 1xPBS	PAA Laboratories	H15-002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00509
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAA Laboratories	A15-101
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F9378
Foetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES)	Roth	9105.3
NaOH, 5 M	clinical pharmacy, hospital	–
Penicillin/Streptomycin (100x)	PAA Laboratories	P11-010
Pipettaid (EXPRESS)	BD (Becton, Dickinson and Company)	357591
Potassiumchlorid	Fluka	60132
Potassiumdihydrogenphospate anhydrous	JT Baker	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JT Baker	3246-01
RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine	Gibco	11879-020
RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine	PAA Laboratories	E15-840
Sodiumhydrogencarbonat	Merck	1.06329.0500

Media and Solutions

Dithizone Solution

• Dissolve 100 mg DTZ in 10 ml DMSO and dilute in 40 ml PBS
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Enzyme Solution

• Dissolve 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 media (without supplements)
• Dissolve 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 media (without supplements)
• Sterile filter the solution (0.22 μm) and keep the enzyme on ice

Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)

• Dissolve 100 ml FBS (heat inactivated)
• Add 450 ml RPMI 1640 (no glucose)
• Add 450 ml RPMI 1640 (11 mM glucose)
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)

• Dissolve 10 ml 1M HEPES (pH 7.4)
• Add 50 ml FBS
• Add 5 ml penicillin/streptomycin (100x)
• Add 2.75 ml 1 M Glucose Solution
• Add 432.25 ml RPMI 1640 (no glucose)
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Euro Collins Solution

• 4,083 g potassium hydrogenphosphate
• 70,0 g glucose
• 2,237 g potassium chloride
• 14,80 g potassium monohydrogenphosphate
• 1,680 g sodium hydrogencarbonate
• 40 ml electrolyte solution (E 154)
• pH 7.4
• Add distilled water up to 2000 ml
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Ficoll Stock Solution

• Add 1000 ml of Euro Collins Solution to 500 g Ficoll
• Add 8.94 g HEPES
• Stir overnight until Ficoll is solved
• pH 7.4
• Measure the density

Ficoll Gradients

• Calculate the amount of FBS, Euro Collins Solution and Ficoll Stock Solution according to the density
• Combine the 3 solutions and measure the density with a densitometer
• Add Euro Collins Solution or Ficoll Stock Solution until the density is adjusted
• Sterile filter the solution (0.22 μm) and store at 4°C