मानव islets के मरीजों को आंशिक रूप से Pancreatectomized से अलगाव
Summary
अनुसंधान के लिए टाइप 2 मधुमेह islets की आपूर्ति अपर्याप्त है. यहाँ हम आंशिक pancreatectomy के दौर से गुजर रोगियों से अलग islets के लिए हमारे प्रोटोकॉल का हिस्सा है. इस दृष्टिकोण टाइप 2 मधुमेह से islets प्राप्त करने के लिए एक अनूठा स्थान का प्रतिनिधित्व करता है और नैदानिक बुनियादी और नैदानिक अध्ययन के लिए पर्याप्त संख्या में गैर मधुमेह विषयों मिलान.
Abstract
टाइप 2 मधुमेह और Langerhans 1 खराबी की islets के रोगजनन में जांच टाइप 2 अंग 2 दाताओं से मधुमेह islets की सीमित उपलब्धता द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है. यहाँ हम मानव अग्नाशय के टाइप 2 मधुमेह और गैर मधुमेह के रोगियों जो आंशिक pancreatectomy अलग अग्नाशय के रोगों (सौम्य या घातक ट्यूमर अग्नाशय, पुरानी pancreatitis के, और आम पित्त नली या ग्रहणी ट्यूमर) के कारण आया है से प्राप्त ऊतक से अलग islets करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल का हिस्सा . सभी शामिल रोगियों इस अध्ययन है, जो भी स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था करने के लिए उनकी सहमति दे दी है. शल्य नमूनों तुरंत रोगविज्ञानी जो आइलेट अलगाव के लिए मुलायम और स्वस्थ दिखने अग्नाशय के ऊतकों को चुना, नैदानिक प्रयोजनों के लिए क्षतिग्रस्त ऊतकों बनाए रखने के लिए दिया गया. हमने पाया है कि 1,000 से अधिक islets अलग के लिए, हम अग्नाशय के ऊतक के कम से कम 2 जी के साथ शुरू किया था. इसके अलावा हमारे प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक दिख ऊतक फैलाना जब एंजाइम युक्त मीडिया इंजेक्शन और बाद में यह कीमा सतह क्षेत्र को बढ़ाने के द्वारा पाचन सहायता के लिए किया गया था.
प्रयोज्यता हमारे प्रोटोकॉल का विस्तार करने के लिए कभी कभी मामले में मानव अग्नाशय के ऊतकों की एक बड़ी राशि (15g>) उपलब्ध है शामिल करने के लिए, हम एक Ricordi कक्ष (50 मिलीलीटर) इस्तेमाल करने के लिए ऊतक को पचाने. पाचन के दौरान, हम मैन्युअल रूप से एक तीव्रता है कि ऊतक तंतुमयता के अपने स्तर के अनुसार नमूना द्वारा विभिन्न पर Ricordi 3 चैम्बर को हिलाकर रख दिया. एक discontinous Ficoll ढाल तो कोष्ठकी ऊतकों से islets अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हम ने कहा है कि ऊतक गोली काफी छोटे homogenously 1.125 ग्राम / मिलीलीटर की एक घनत्व के साथ Ficoll मध्यम में resuspended होना चाहिए. अलगाव के बाद, हम कम से कम 48 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ तनाव मुक्त (नहीं मिलाते या रोटेशन) 37 ° शर्तों सी के तहत islets के क्रम में उनके कार्यात्मक वसूली की सुविधा के लिए सुसंस्कृत. हमारे प्रोटोकॉल और उसके भविष्य के सुधार के व्यापक आवेदन मधुमेह से मानव islets की एक बड़ी मात्रा के समय पर कटाई और चिकित्सकीय मिलान गैर मधुमेह विषयों सक्षम, बहुत टाइप 2 मधुमेह अनुसंधान अग्रिम कर सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे प्रोटोकॉल का प्रयोग, मानव islets अग्नाशय के एक आंशिक pancreatectomy से एकत्र ऊतक से अलग किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल की सफलता के कुछ महत्वपूर्ण बिंदुओं के दौरान लिया देखभाल पर निर्भर करता है. बीटा सेल व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए, यह आवश्यक है कि नमूना प्रयोगशाला में बर्फ पर तेजी से ले जाया जा. इसके अतिरिक्त, ऊतक पाचन की अवधि के ऊतक तंतुमयता और मीडिया के enzymatic गतिविधि के ग्रेड के अनुसार empirically अनुकूलित चाहिए. यह यांत्रिक Ricordi चैम्बर के लिए मैन्युअल रूप से लागू बल की डिग्री के लिए भी सच है. एक अच्छा आइलेट उपज प्राप्त करने के इस प्रकार, प्रोटोकॉल सबसे अच्छा एक समर्पित वैज्ञानिक या तकनीकी सहायक द्वारा किया जाता है. प्रारंभिक विफलता आदर्श है जब तक कि टीम पहले से ही आइलेट अलगाव में अनुभवी है.
हमारे आइलेट अलगाव प्रोटोकॉल और मानक मानव आइलेट अलगाव विधि के बीच प्रमुख मतभेद रहे हैं: 1) हालांकि हम अग्नाशय ischemia के कई घंटे के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान अधीन ऊतक का उपयोग, इसे तुरंत साइट पर संसाधित है. यह अग्न्याशय आइलेट / प्रत्यारोपण के लिए मस्तिष्क मृत दाताओं, जो आवंटन और आइलेट अलगाव की सुविधा के लिए प्रसव के दौरान कई घंटे के लिए इस्कीमिक रहना से explanted pancreata इसके विपरीत में है. 2) हम अग्नाशय के ऊतकों में सीधे collagenase इंजेक्षन, जबकि मानक प्रोटोकॉल के लिए यह अग्नाशयी नलिका में पानी में डालना है. 3) हम एक सतत Ficoll COBE सेल प्रोसेसर का उपयोग कर ढाल से islets एकत्रित करने के बजाय एक असंतत Ficoll ढाल का उपयोग islets अलग.
मामलों में जहां शल्य नमूना भी fibrotic या islets की एक पर्याप्त संख्या को अलग करने के लिए दुर्लभ है, ऊतक अभी भी लेजर कब्जा microdissection (LCM) 10 द्वारा लिया जा सकता है. इस जीन की अभिव्यक्ति डेटा लगभग हर नमूना से बरामद करने के लिए, भले ही आइलेट अलगाव विफल रहता है या उपज बहुत कम है की अनुमति देता है. दुर्भाग्य से, LCM कार्यात्मक अध्ययन के लिए जीवित कोशिकाओं का उत्पादन नहीं करता है और उनकी राशि आमतौर पर प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए अपर्याप्त है. इस प्रकार, हमारे collagenase पाचन प्रोटोकॉल के साथ समानांतर में LCM का उपयोग करने के लिए islets पुनर्प्राप्त शल्य नमूनों की प्रक्रिया का सबसे प्रभावी तरीका हो सकता है.
जब आंशिक pancreatectomies से आइलेट अलगाव के लिए ऊतक एकत्रित, यह महत्वपूर्ण है को ध्यान से रोगी के नैदानिक इतिहास और चयापचय राज्य की जांच. एक आंशिक रूप से pancreatectomized रोगी प्रकार -3 सी मधुमेह, अग्नाशय के 6 सर्जरी के लिए प्रमुख विकार के लिए माध्यमिक यानी मधुमेह से प्रभावित हो सकता है. 43 भाग लेने वाले रोगियों जो 2010 में हमारे विभाग में इस सर्जरी के अलावा, 32 गैर मधुमेह थे, 5 टाइप 2 मधुमेह और 6 से प्रभावित थे प्रकार -3 सी मधुमेह था. ये आंकड़े पिछले अध्ययनों और अग्नाशय के कैंसर या पुरानी अग्नाशयशोथ 6 से पीड़ित रोगियों का एक बड़ा अंश में बिगड़ा ग्लूकोज चयापचय और मधुमेह की ओर इशारा करते के साथ सहमत हूँ. हम मधुमेह पर विचार करने के लिए प्राथमिक मूल के हो सकता है अगर यह कम से कम एक साल का निदान अग्नाशय 7 सर्जरी करने के लिए अग्रणी लक्षण की शुरुआत से पहले था. आइलेट autoantigens के खिलाफ एंटीबॉडी के स्तर को भी 8 मधुमेह के एक संभावित autoimmune मूल का मूल्यांकन करने के लिए मापा जाना चाहिए. क्योंकि एक pancreatectomy दौर से गुजर रोगी मधुमेह undiagnosed से ग्रस्त या ग्लूकोज असहिष्णु हो सकता है, सभी गैर मधुमेह के रोगियों को एक मौखिक शर्करा सहिष्णुता पहले 9 pancreatectomy के लिए परीक्षण दिया जाना चाहिए .
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम हमारे कई सहयोगियों जो इस परियोजना के विभिन्न चरणों में मदद, सलाह और महत्वपूर्ण इनपुट प्रदान को धन्यवाद देना चाहता हूँ. इस वीडियो के लेख का उत्पादन शिक्षा और अनुसंधान (BMBF) के लिए जर्मन जर्मन मधुमेह (DZD, अनुसंधान के लिए केंद्र मंत्रालय से धन के साथ समर्थित किया गया था http://www.dzd-ev.de ), IMIDIA (http://www imidia.org ) और विश्वविद्यालय अस्पताल प्रौद्योगिकी ड्रेसडेन के विश्वविद्यालय में कार्ल गुस्ताव Carus. इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान अनुदान समझौता ° पता 115005 के तहत अभिनव चिकित्सा पहल के लिए यूरोपीय समुदाय सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) से धन प्राप्त किया है.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Equipment | ||
| 1 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 604181 |
| 10 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 607180 |
| 25 ml serological pipette (CELLSTAR) | greiner bio-one | 760180 |
| 10 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300912 |
| 50 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 300865 |
| 5 ml Syringe | BD (Becton, Dickinson and Company) | 309050 |
| 18 G 1,1/2 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 304622 |
| 27 Gx1/2 Needle | Braun | 4658300 |
| 27 Gx3/4 Needle Microlance 3 | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302200 |
| 3 cm cell culture dish 2×2 mm grid | Nunc | 174926 |
| 20 cm Tissue culture dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 353003 |
| 6 cm Easy grip petri dish | BD (Becton, Dickinson and Company) | 351016 |
| 150 ml storage bottle | Corning Incorporated | 431175 |
| 250 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 36 |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | Schott Duran | 21 217 44 |
| 250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube | Corning Incorporated | 430776 |
| 50 ml Falcon conical tube | BD (Becton, Dickinson and Company) | 352070 |
| 260 ml Easyflask Non-treated | Nunc | 156800 |
| Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm) | Millipore | SLGV033RB |
| Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume) | Corning Incorporated | 431118 |
| Densitometer (Densito 30PX) LWE37463 | Mettler Toledo | 51324450 |
| Fast PES Filter Unit 0,2 μm | Nalgene | 569-0020 |
| Heating Coil | BioRep Technologies Inc | HC-02 |
| Multifuge 4 KS-R | Heraeus | 75015680 |
| Pump Typ PD5206 | Heidolph | 523-52060-00-2 |
| Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter) | BioRep Technologies Inc. | Model 50-U-01, Serial 0503-001 |
| Preparation Stand | BioRep Technologies Inc. | 50-PS-01 |
| O-Rings | BioRep Technologies Inc. | OR-50-U-01 |
| Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9) | BioRep Technologies Inc. | SN-01 |
| Silicon Tubing | Tygon | R 3603 8,0X4,0 mm |
| Surgical forceps | Braun | BD168R |
| Surgical scissors (Aesculap) | Braun | BC273R |
| Water bath OLS 200 | Grant | OLS 200 |
| Reagents | ||
| Collagenase -> Liberase RI (100 mg) | Roche | 11815032001 |
| D(+)-Glucose | Merck | 1.08337.1000 |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Merck | 1.16743.1000 |
| Diphenylthiocarbazone (DTZ) | Sigma Aldrich | D5130 |
| DNase I (100 mg) | Roche | 10104159001 |
| Dulbeccos 1xPBS | PAA Laboratories | H15-002 |
| Electrolytsolution E154 | Serumwerk | 00509 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA Laboratories | A15-101 |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378 |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 |
| 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES) | Roth | 9105.3 |
| NaOH, 5 M | clinical pharmacy, hospital | – |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | PAA Laboratories | P11-010 |
| Pipettaid (EXPRESS) | BD (Becton, Dickinson and Company) | 357591 |
| Potassiumchlorid | Fluka | 60132 |
| Potassiumdihydrogenphospate anhydrous | JT Baker | 0241 |
| Potassiummonohydrogenphosphate | JT Baker | 3246-01 |
| RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine | Gibco | 11879-020 |
| RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine | PAA Laboratories | E15-840 |
| Sodiumhydrogencarbonat | Merck | 1.06329.0500 |
Media and Solutions
Dithizone Solution
- Dissolve 100 mg DTZ in 10 ml DMSO and dilute in 40 ml PBS
- Sterile filter the solution (0.22 μm)
Enzyme Solution
- Dissolve 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 media (without supplements)
- Dissolve 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 media (without supplements)
- Sterile filter the solution (0.22 μm) and keep the enzyme on ice
Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)
- Dissolve 100 ml FBS (heat inactivated)
- Add 450 ml RPMI 1640 (no glucose)
- Add 450 ml RPMI 1640 (11 mM glucose)
- Sterile filter the solution (0.22 μm)
Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)
- Dissolve 10 ml 1M HEPES (pH 7.4)
- Add 50 ml FBS
- Add 5 ml penicillin/streptomycin (100x)
- Add 2.75 ml 1 M Glucose Solution
- Add 432.25 ml RPMI 1640 (no glucose)
- Sterile filter the solution (0.22 μm)
Euro Collins Solution
- 4,083 g potassium hydrogenphosphate
- 70,0 g glucose
- 2,237 g potassium chloride
- 14,80 g potassium monohydrogenphosphate
- 1,680 g sodium hydrogencarbonate
- 40 ml electrolyte solution (E 154)
- pH 7.4
- Add distilled water up to 2000 ml
- Sterile filter the solution (0.22 μm)
Ficoll Stock Solution
- Add 1000 ml of Euro Collins Solution to 500 g Ficoll
- Add 8.94 g HEPES
- Stir overnight until Ficoll is solved
- pH 7.4
- Measure the density
Ficoll Gradients
- Calculate the amount of FBS, Euro Collins Solution and Ficoll Stock Solution according to the density
- Combine the 3 solutions and measure the density with a densitometer
- Add Euro Collins Solution or Ficoll Stock Solution until the density is adjusted
- Sterile filter the solution (0.22 μm) and store at 4°C
References
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