Изоляция по правам островки из не вполне Pancreatectomized Пациенты

Summary

Поставка диабетом 2 типа островков для исследований является недостаточным. Здесь мы делимся нашими протоколом для изоляции островков из пациентов, перенесших частичную поджелудочной железы. Этот подход представляет собой уникальное место для получения островков с диабетом 2 типа и клинически соответствует, не больных диабетом в достаточном количестве для фундаментальных и клинических исследований.

Abstract

Исследования в патогенезе сахарного диабета 2 типа и островков Лангерганса неисправности ¹ были затруднены ограниченной доступности диабетом 2 типа островков с донорами органов ^2. Здесь мы делимся нашими протоколом для изоляции островков из человеческой ткани поджелудочной железы получены из диабетом 2 типа и без диабета пациенты, которые подверглись частичной поджелудочной железы из-за различных заболеваний поджелудочной железы (доброкачественная или злокачественная опухоль поджелудочной железы, хронический панкреатит, и общего желчного протока и двенадцатиперстной кишки опухоли) . Все пациенты участвуют дали свое согласие на это исследование, которое также было одобрено местным этическим комитетом. Хирургических образцов были немедленно доставлены в патологоанатом, внесшие мягкие и здоровые ткани поджелудочной железы появляются выделения островок, сохраняя поврежденной ткани в диагностических целях. Мы обнаружили, что выделить более 1000 островков, нам надо было начинать, по крайней мере 2 г ткани поджелудочной железы. Также важное значение для нашего протокола было заметно разбухают ткани при введении фермента средах, а затем фарш ей помочь пищеварению за счет увеличения площади поверхности.

Чтобы расширить сферу применения нашего протокола включить случайный случай, когда большое количество (> 15 г) тканей человека поджелудочной доступна, мы использовали Ricordi камеры (50 мл) переваривать ткань. Во время переваривания, мы вручную покачал Ricordi камеру ³ при интенсивности, которая колебалась от образца в соответствии с его уровнем тканях фиброз. Градиент discontinous Ficoll затем был использован для отдельных островков из ацинарных ткани. Мы отметили, что ткани гранулы должны быть достаточно маленькими, чтобы быть однородно ресуспендировали в среде Ficoll с плотностью 1,125 г / мл. После изоляции, мы культурные островки под напряжением свободных условиях (без встряхивания или вращение) с 5% CO ₂ при 37 ° С, по крайней мере 48 часов для того, чтобы облегчить их функциональное восстановление. Широкое применение нашего протокола и его улучшения в будущем могло бы позволить своевременной уборки большого количества человеческих островков от диабетической и клинически соответствует, не больных диабетом, в значительной степени продвижения сахарного диабета 2 типа исследований.

Protocol

1. Поджелудочной ткани коллекции в операционной Хирург выполняет частичная резекция поджелудочной железы. После размещения поджелудочной образца в окно на льду, доставить его немедленно патологоанатомом. 2. Ткань выбор для изоляции островок Патологоанатом выбирает ткань, которая появляется мягкий и здоровым, сохраняя поврежденной ткани в диагностических целях. Фиброзных тканей и образцов, предлагая менее 2 г полезной ткани исключены из островок изоляции. Погрузите ткани поджелудочной железы в растворе Евро Коллинз и поставить на лед в лабораторию. 3. Выделение человека островков Взвесьте ткани поджелудочной железы, а затем поместить его в 10 см блюдо. Положить 150 мл RPMI СМИ в 500 мл колбу. В 250 мл колбу, подготовить решение пищеварительный фермент, объединяя 130 мл RPMI сред с 100 мг / мл ДНКазы и 20 мл РИ Liberase 5mg/ml. Draw 10 мл этого раствора в шприц для введения ткани поджелудочной железы. Inject пищеварительных ферментов решение в ткани поджелудочной железы, с целью раздувать это однородно. Если это предотвратить, фиброз, пищеварения, скорее всего, удастся. Затем фарш ткани в ~ 4 мм 3 штуки на льду. 4. Человек цепь пищеварения поджелудочной железы Соберите пищеварения цепи, как показано на рисунке 1. Направление потока в камере Ricordi в внизу и снаружи в верхней части камеры. Добавить оставшийся раствор пищеварительного фермента 500 мл колбу до общего объема 300 мл и вставьте термометр. Передача ткани поджелудочной железы в камеру, вставьте сетки (диаметр пор: 600 мкм) и три нитрида кремния Мрамор (диаметр 15 мм), закрыть камеру и включите насос с потоком установлена ​​на уровне 140 мл / мин. Когда температура достигает схеме 37 ° С, начала отсчета времени и периодически брать пробы, чтобы определить когда нужно остановиться пищеварения. Окрашивание дитизоном (2 мг / мл) позволяет микроскопическим визуализации островков в переваривается ткани 4. Как только островки отделены от окружающих ацинарных ткани, быстро остановить пищеварения, разместив нагреватель на льду и добавлением 200 мл холодной СМИ мыть (900 мл RPMI 1640 с 5,5 мМ глюкозы и 10% FBS) к цепи. Сбор островок раствора в 250 мл конические пробирки, как он выходит из пробирки. Продолжайте, пока цепь пуста. Рисунок 1. Человека цепь пищеварения поджелудочной железы человека цепь пищеварения поджелудочной железы включает в себя камеру Ricordi содержащие сетки (диаметр пор: 600 мкм) и три из нитрида кремния мрамора (диаметр 15 мм). Отток из камеры приводится в колбу коллекции ткани перистальтического насоса (140 мл / мин). Стрелки указывают направление потока. Оптимальная температура для ферментативного пищеварения поддерживается путем погружения нагревательная спираль в 37 ° С водяной бане. 5. Стиральная после пищеварения Центрифуга 250 мл конические пробирки, содержащие островок решения при 1000 оборотах в минуту, 4 ° С в течение 5 мин. Удалите надосадочную, ресуспендируют островок гранул в промывочной СМИ (900 мл RPMI 1640 с 5,5 мМ глюкозы и 10% FBS) и распространять ее в равные доли по 50 мл конические пробирки. (Дополнительно:. Распределить на дополнительные конические пробирки для улучшения промывки) центрифуги при 1000 оборотах в минуту, 4 ° С в течение 5 мин. Удалите супернатант и осторожно освободите гранулы ручным встряхиванием. 6. Очистка от градиента Ficoll Ресуспендируют гранулу Ficoll средств массовой информации с плотностью 1,125 г / мл, рН 7,4 и медленно наложения 10 мл аликвоты Ficoll сред с плотностью 1,080, 1,060 и 1,037 г / мл. Центрифуга Ficoll градиентов при 2400 оборотах в минуту, 4 ° С в течение 20 мин. 7. Островок Сбор и культуры После центрифугирования, различные компоненты тканей можно отличить по их разделами в градиент. Удалите верхний слой, состоящий из жира и соединительной ткани. Тщательно урожая первый слой островок агрегатов на 1.037-1.060 г / мл интерфазе. Этот слой содержит самые чистые изолированных островков. Сбор фракций отдельно для эффективной изоляции. Сбор второй, менее чистые долю островок агрегатов на 1.060-1.080 г / мл интерфазе. Развести Ficoll градиент, добавив мыть СМИ (900 мл RPMI 1640 с 5,5 мМ глюкозы и 10% ЭТС) к каждой конической трубе до общего объема 50 мл. Центрифуга при 1000 оборотах в минуту, 4 ° С в течение 5 мин. Удалите супернатант всасывания. Будьте осторожны, как шарик может быть потеряно из-за градиента Ficoll. Вымойте гранулы шго мытья СМИ (900 мл RPMI 1640 с 5,5 мМ глюкозы и 10% ЭТС) и центрифуге при 1000 оборотов в минуту, 4 ° С в течение 5 мин. Повторите использованием средств массовой информации островок культуры Ресуспендируют островков в культуре средств массовой информации и разместить их в инкубаторе с 5% CO 2 при 37 ° С в течение 24-48 часов перед дальнейшей обработкой.

Representative Results

Наш протокол дали в среднем ~ 500 островков на грамм ткани поджелудочной железы, хотя это очень разнообразны между препаратами связаны преимущественно с различиями в фиброз и активность коллагеназы. Мы достигли> 90% островок чистоты первым окрашиванием дитизона во время обработки ткани, то готовя их через 24 часа после изоляции. Для определения качества очищенной островков, мы тестировали в течение 25 мМ глюкозы-стимулированная секреция инсулина в статических условиях в течение 2 часов. Мы обнаружили, секреция инсулина сравнима с островками получена из ECIT островок изоляции и центров трансплантации. Как островков изолированы от частично pancreatectomized pancreata не предназначены для трансплантации островков, оценка общего IEQ не считается критическим фактором. Важно отметить, что наш метод позволил нам выделить островки для функциональных исследований, проведенных в 25 частичном pancreatectomized пациентов в период между 2005 и 2008 5. Эти островки были проанализированы на глюкозо-стимулированную секрецию инсулина и конкретное выражение белка западных промокательной и иммуногистохимии. Островки изолированы от частично pancreatecomized pancreata также может быть использован для сравнения генов и экспрессии белка профилей, ультраструктурным внешний вид и функциональные ответы, не страдающих диабетом и диабетической островков. Поскольку Есть более пациентов, перенесших частичную поджелудочной железы, чем Есть доноров органов, наш протокол может обеспечить достаточное образцы и данные должны быть собраны для надежного статистического анализа.

Discussion

Используя наш протокол, человеческих островков можно выделить из ткани поджелудочной железы собранных из частичное поджелудочной железы. Успех этого протокола зависит от того, насколько бережно в течение нескольких критических точках. Чтобы сохранить бета-клеток жизнеспособность, очень важно, чтобы образец быстро перевозиться на льду в лабораторию. Кроме того, продолжительность пищеварения ткани должны быть оптимизированы в соответствии с эмпирически степени фиброза тканей и ферментативной активности средств массовой информации. Это также относится и к степени механической силы, приложенной вручную Ricordi камеры. Таким образом, чтобы получить хороший урожай островок, протокол лучше поручать посвященный ученому или техническим помощником. Первоначальные неудачи является нормой, если команда уже имеет опыт в островок изоляции.

Есть ключевые различия между нашими островок протокол изоляции и стандартный человеческий метод изоляции островок: 1) Хотя мы используем ткани поджелудочной железы подвергается несколько часов ишемии во время хирургической процедуры, они сразу же обрабатываются на месте. Это в отличие от pancreata эксплантированных от смерть мозга доноров для поджелудочной железы / островок трансплантации, которые остаются ишемическая течение нескольких часов во время распределения и доставки на островок средство изоляции. 2) Мы коллагеназы вводить прямо в ткани поджелудочной железы, в то время как стандартный протокол влить его в проток поджелудочной железы. 3) Мы отдельных островков использовании разрывных градиент Ficoll вместо сбора островки с непрерывным градиентом Ficoll использованием COBE процессор клетки.

В случаях, когда хирургическое образца слишком фиброзных или скудные выделения достаточного количества островков, ткани все еще ​​может быть восстановлена ​​путем лазерной захвата микродиссекции (НОК) ^10. Это позволяет использовать данные экспрессии генов, чтобы быть восстановлены практически из каждого образца, даже если островок изоляции сбоя или выхода, очень низок. К сожалению, НОК не производит живые клетки для функциональных исследований и их количество, как правило, недостаточно для протеомных анализа. Таким образом, используя LCM параллельно с нашим протоколом пищеварения коллагеназы для получения островков может быть наиболее эффективным способом для обработки хирургических образцов.

При сборе ткани для островок изоляции от частичной pancreatectomies, важно, чтобы тщательно изучить историю болезни пациента и метаболическое состояние. Частично pancreatectomized пациента могут быть затронуты типа 3c диабет, то есть диабет вторичной по отношению к поджелудочной расстройства, ведущие к операции ^6. Среди 43 участвующих пациентов, которые подверглись этой операции в нашем отделении в 2010 году, 32 были без диабета, 5 пострадали от диабета типа 2 и 6 был диабет типа 3c. Эти данные согласуются с предыдущими исследованиями, указывая на нарушения метаболизма глюкозы и диабета в значительной долей пациентов, страдающих от рака поджелудочной железы или хронического панкреатита ^6. Мы рассматривали диабет как первостепенные происхождения, если она была диагностирована по крайней мере за год до появления симптомов, ведущих к поджелудочной железы ^7. Уровень антител против островок аутоантигенов также должны быть измерены для оценки потенциальных аутоиммунного происхождения из сахарного диабета ^8. Потому что пациент переживает поджелудочной железы может страдать от недиагностированных диабетом или глюкозы нетерпимой, все не больных сахарным диабетом следует уделять перорального теста на толерантность к глюкозе до поджелудочной железы ^9.

Materials

Name	Company	Catalogue number
Equipment
1 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	604181
10 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	607180
25 ml serological pipette (CELLSTAR)	greiner bio-one	760180
10 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	300912
50 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	300865
5 ml Syringe	BD (Becton, Dickinson and Company)	309050
18 G 1,1/2 Needle Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	304622
27 Gx1/2 Needle	Braun	4658300
27 Gx3/4 Needle Microlance 3	BD (Becton, Dickinson and Company)	302200
3 cm cell culture dish 2×2 mm grid	Nunc	174926
20 cm Tissue culture dish	BD (Becton, Dickinson and Company)	353003
6 cm Easy grip petri dish	BD (Becton, Dickinson and Company)	351016
150 ml storage bottle	Corning Incorporated	431175
250 ml Erlenmeyer flasks	Schott Duran	21 217 36
500 ml Erlenmeyer flasks	Schott Duran	21 217 44
250 ml Screw Cap Conical Bottom Centrifuge Tube	Corning Incorporated	430776
50 ml Falcon conical tube	BD (Becton, Dickinson and Company)	352070
260 ml Easyflask Non-treated	Nunc	156800
Millex GV Filter Unit Duropore (0,22 μm)	Millipore	SLGV033RB
Bottle Top Vacuum Filter (PES 70 mm Diameter Membran, 0,22 μm pore size, 45 mm neck size, 500 mL volume)	Corning Incorporated	431118
Densitometer (Densito 30PX) LWE37463	Mettler Toledo	51324450
Fast PES Filter Unit 0,2 μm	Nalgene	569-0020
Heating Coil	BioRep Technologies Inc	HC-02
Multifuge 4 KS-R	Heraeus	75015680
Pump Typ PD5206	Heidolph	523-52060-00-2
Ricordi chamber (metal mesh with 600 μm pore diameter)	BioRep Technologies Inc.	Model 50-U-01, Serial 0503-001
Preparation Stand	BioRep Technologies Inc.	50-PS-01
O-Rings	BioRep Technologies Inc.	OR-50-U-01
Silicon Nitride Marbles (15 mm set of 9)	BioRep Technologies Inc.	SN-01
Silicon Tubing	Tygon	R 3603 8,0X4,0 mm
Surgical forceps	Braun	BD168R
Surgical scissors (Aesculap)	Braun	BC273R
Water bath OLS 200	Grant	OLS 200
Reagents
Collagenase -> Liberase RI (100 mg)	Roche	11815032001
D(+)-Glucose	Merck	1.08337.1000
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Merck	1.16743.1000
Diphenylthiocarbazone (DTZ)	Sigma Aldrich	D5130
DNase I (100 mg)	Roche	10104159001
Dulbeccos 1xPBS	PAA Laboratories	H15-002
Electrolytsolution E154	Serumwerk	00509
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAA Laboratories	A15-101
Ficoll 400	Sigma Aldrich	F9378
Foetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfons‰ure (HEPES)	Roth	9105.3
NaOH, 5 M	clinical pharmacy, hospital	–
Penicillin/Streptomycin (100x)	PAA Laboratories	P11-010
Pipettaid (EXPRESS)	BD (Becton, Dickinson and Company)	357591
Potassiumchlorid	Fluka	60132
Potassiumdihydrogenphospate anhydrous	JT Baker	0241
Potassiummonohydrogenphosphate	JT Baker	3246-01
RPMI Medium 1640 [-]D-Glucose [+]L-Glutamine	Gibco	11879-020
RPMI Medium 1640 [+]L-Glutamine	PAA Laboratories	E15-840
Sodiumhydrogencarbonat	Merck	1.06329.0500

Media and Solutions

Dithizone Solution

• Dissolve 100 mg DTZ in 10 ml DMSO and dilute in 40 ml PBS
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Enzyme Solution

• Dissolve 100 mg Liberase RI in 20 ml RPMI 1640 media (without supplements)
• Dissolve 100 mg DNase in 1 ml RPMI 1640 media (without supplements)
• Sterile filter the solution (0.22 μm) and keep the enzyme on ice

Wash media (1000ml/5.5mM Glucose)

• Dissolve 100 ml FBS (heat inactivated)
• Add 450 ml RPMI 1640 (no glucose)
• Add 450 ml RPMI 1640 (11 mM glucose)
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Islet culture media (500ml/5,5mM Glucose)

• Dissolve 10 ml 1M HEPES (pH 7.4)
• Add 50 ml FBS
• Add 5 ml penicillin/streptomycin (100x)
• Add 2.75 ml 1 M Glucose Solution
• Add 432.25 ml RPMI 1640 (no glucose)
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Euro Collins Solution

• 4,083 g potassium hydrogenphosphate
• 70,0 g glucose
• 2,237 g potassium chloride
• 14,80 g potassium monohydrogenphosphate
• 1,680 g sodium hydrogencarbonate
• 40 ml electrolyte solution (E 154)
• pH 7.4
• Add distilled water up to 2000 ml
• Sterile filter the solution (0.22 μm)

Ficoll Stock Solution

• Add 1000 ml of Euro Collins Solution to 500 g Ficoll
• Add 8.94 g HEPES
• Stir overnight until Ficoll is solved
• pH 7.4
• Measure the density

Ficoll Gradients

• Calculate the amount of FBS, Euro Collins Solution and Ficoll Stock Solution according to the density
• Combine the 3 solutions and measure the density with a densitometer
• Add Euro Collins Solution or Ficoll Stock Solution until the density is adjusted
• Sterile filter the solution (0.22 μm) and store at 4°C