गंध - पैदा प्रतिक्रियाएँ में कैल्शियम इमेजिंग ड्रोसोफिला Antennal लोब

Summary

हम एक स्थापित करने के लिए उपाय और रहने के antennal लोब में गंध पैदा कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण तकनीक का वर्णन<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em>.

Abstract

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb^1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.

Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe – traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) – has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects^6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP^11,12 and Cameleon¹³, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin^14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin¹⁶ has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties^2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS¹⁸, LexA/LexAop^19,20, Q system²¹) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed^22-24.

Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP^25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Protocol

1. बढ़ते ब्लॉक सभा plexiglass बढ़ते खंड (चित्रा 1 ए) खाका में दिए गए सटीक विनिर्देशों के लिए किया जाना चाहिए (उपलब्ध से http://neuro.uni-konstanz.de/j / ove_mountingblock_blueprint ) मक्खी के आसान और बढ़ते विच्छेदन की अनुमति देने के लिए. वापस से शिकंजा के माध्यम से धागा लेकिन ब्लॉक के सामने से परे का विस्तार नहीं है उन्हें, उनकी स्थिति जानवर की तैयारी के दौरान समायोजित किया जाएगा (2.7 देखें). एक सटीक ड्रिल का प्रयोग, मक्खी के लिए परिपत्र कक्ष के ऊपरी सीमा में सेंध, मक्खी शरीर के लिए जगह बनाने के लिए, इस बिंदु पर ब्लॉक की मोटाई कम करने के लिए सतह के नीचे खुदाई. एक स्केलपेल सीधा के साथ एक तांबे ग्रिड कटौती और भट्ठा के नीचे बंद करने के लिए एक "कॉलर" बना. सुनिश्चित करें कि दो परिणामस्वरूप फ्लैप स्तर हैं, मक्खी के रूप में इस प्रविष्टि में मदद मिलेगी. एक दंर्तखोदनी के साथ, मक्खी के लिए परिपत्र कक्ष ऊपर बढ़ते ब्लॉक पर superglue की एक छोटी सी बूंद जगह है. गोंद और स्थिति पर तांबा ग्रिड रखें इतना है कि भट्ठा (चित्र 1 ए) ब्लॉक पर केंद्रित है. धीरे नीचे प्रेस और किसी भी अतिरिक्त गोंद को हटा दें. चिमटी की एक जोड़ी के साथ, प्रत्येक पक्ष पर flaps के तहत गोंद के छोटे बूंदों को जोड़ सकते हैं और ग्रिड गुना ब्लॉक ताकि भट्ठा सीधे नीचे की ओर इशारा कर रहा है के मोर्चे पर. सुनिश्चित करें कि ब्लॉक के साथ ग्रिड के शीर्ष स्तर है. पूरी तरह से सूखे के लिए अनुमति देते हैं. एक तार धारक इकट्ठा: आधे में एक प्लास्टिक coverslip कटौती के और एक केंद्रीय टुकड़ा दूर करने के लिए एक 'यू' आकार. 'यू' के शीर्ष भर में तार का एक टुकड़ा गोंद करने के लिए मोम का प्रयोग करें, तार भी तना हुआ नहीं है. स्पर्शतंतु संबंधी ढाल का निर्माण: एक कागज छेद पंच के साथ एक प्लास्टिक coverslip में एक छेद बना. 0.5 x 0.7 सेमी coverslip के किनारों को छाँटो. चिपचिपा टेप करने के लिए छेदा प्लास्टिक coverslip और फिर टेप पर इथेनॉल के एक ड्रॉप करने के लिए छेद के माध्यम से उजागर जगह गोंदचिपकने वाला हटाने के. 2. पशु तैयारी उपयुक्त जीनोटाइप की मक्खियों यानी "ड्राइवर" और गतिविधि संवाददाता transgenes के वांछित संयोजन असर 1-3 सप्ताह पुराना होना चाहिए, छोटी मक्खियों की छल्ली बहुत नरम और मुश्किल में कटौती है. जब प्रयोगों अलग जीनोटाइप का प्रत्यक्ष तुलना की आवश्यकता है, और आदेश में transgene अभिव्यक्ति के स्तर मैच, मक्खियों उम्र से संबंधित शारीरिक मतभेद से बचने उम्र से मिलान होना चाहिए. यदि लिंग महत्वपूर्ण नहीं है, हम के बाद से वे बड़ा सिर है और हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं महिला मक्खियों का उपयोग करने के लिए पसंद करते हैं. बर्फ पर ठंडा करके मक्खियों असंवेदनता उत्पन्न करना. बढ़ते ब्लॉक में एक मक्खी का परिचय. विंग संयुक्त द्वारा मक्खी पकड़ और यह स्लाइड, तांबा ग्रिड की भट्ठा के साथ पहली पृष्ठीय – सतह, इतना है कि यह अपनी गर्दन (चित्रा 1B सी) द्वारा निलंबित कर दिया है. यदि आवश्यक हो, यह बारी बारी से जब तक यह नीचे देख रहा है. च के सामने एक अच्छा कैक्टस रीढ़ रखेंly बचने (चित्रा 1 बी सी) से रोकने के सिर. सूंड के सामने कैक्टस रीढ़ रखें करने के लिए इसे बढ़ने से रोका जा सके. कैक्टस मोम का उपयोग ब्लॉक करने के लिए रीढ़ की हड्डी को ठीक करें. सुनिश्चित करें कि सिर के ऊपर ब्लॉक के शीर्ष स्तर है. राल का एक छोटा सा ड्रॉप (इथेनॉल में भंग) के साथ ब्लॉक करने के लिए मक्खी के सिर फिक्स. एक humidified बॉक्स में ब्लॉक प्लेस और के बारे में एक घंटे के लिए कठोर राल के लिए अनुमति देते हैं. संदंश का प्रयोग, स्पर्शतंतु संबंधी थाली आगे खींचने के लिए और धारक (बाहर मोम की ओर, 1.5 देखें) पर तार छोड़ ऐन्टेना और सिर के बीच में चर्म संबंधी गुना में. ब्लॉक के सामने मोम के साथ धारक को ठीक करें. ब्लॉक में बनाया शिकंजा का प्रयोग, धीरे तार धारक को आगे बढ़ाने के लिए स्पर्शतंतु संबंधी थाली और सिर के बीच में कुछ जगह बनाने. मक्खी सिर के शीर्ष पर केन्द्र में तैनात छेद के साथ antennal ढाल (1.6 देखें) रखें. मोम साथ बढ़ते ब्लॉक के शीर्ष करने के लिए तय कर लो. एक ब्लेड फाड़नेवाला, घन का उपयोगटा ढाल पर टेप में छोटा सा छेद ऐन्टेना पीछे मक्खी के सिर की छल्ली को उजागर. छेद आंखों से परे का विस्तार करने के लिए लीक से तैयारी रोकने चाहिए. दो घटक सिलिकॉन के साथ टेप और छल्ली बीच में छेद सील. मक्खी सिर के ऊपर से किसी भी अधिक सिलिकॉन निकालें. की एक बूंद प्लेस ड्रोसोफिला की घंटी सिर पर खारा (130 मिमी, NaCl 5 मिमी KCl, 2 मिमी 2 MgCl, 2 मिमी 2 CaCl, 36 मिमी सैकरोज, 5 मिमी HEPES, 7.3 पीएच). एंटीना पूरी तरह से सूखे रहना चाहिए: सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई लीक कर रहे हैं. एक नीलमणि ब्लेड का प्रयोग, छल्ली में एक छेद में कटौती. पहले, हल्के से सीधे ऐन्टेना पीछे चर्म संबंधी गुना के साथ स्कोर है, तो पीठ पर आंखों के साथ और ocelli भर में कटौती. अंत में, रन किनारे पर छल्ली का टुकड़ा गुना और नीचे से काट स्पर्शतंतु संबंधी नसों विच्छेद से बचने के लिए. ध्यान से ठीक चिमटी के साथ ग्रंथियों और ट्रेकिआ हटा दें. ड्रोसोफिला के साथ बार बार कुल्ला </उन्हें> घंटी, सिर पर एक बड़ी गिरावट छोड़ने. 3. गंध प्रोत्साहन वितरण गंध सीरिंज: 2 मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज में एक सेलूलोज़ पैड, पर यह साफ संदंश और विंदुक (फिल्टर युक्तियों का उपयोग) μl 20 गंध की, पतला के रूप में एक उपयुक्त विलायक में वांछित के साथ सम्मिलित विंदुक टिप का उपयोग बैरल में गहरी पैड धक्का . प्लग और टोपी सिरिंज जब तक की आवश्यकता है. ताजा गंध dilutions कम से कम हर 3 महीने (अत्यधिक अस्थिर और / या अक्सर इस्तेमाल किया odors के लिए या अधिक बार) तैयार किया जाना चाहिए, और नए पैड प्रत्येक रिकॉर्डिंग सत्र से पहले ही गंध सीरिंज के लिए तैयार किया जाना चाहिए. तीन से अधिक stimulations के लिए गंध पैड का उपयोग न करें, क्योंकि गंध एकाग्रता क्षय हो सकता है. कस्टम olfactometer (चित्रा 2): एक प्राथमिक हवा धारा (1 एल / मिनट) Teflon टयूबिंग (0.4 मिमी आंतरिक व्यास) के माध्यम से निर्देशित है, इस ट्यूब के बाहर, एक माध्यमिक हवा धारा (1 एल / मिनट की नदी के ऊपर 27 सेमी ) जोड़ा जाता है. दोनों हवा धाराओं झिल्ली पंप द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं, औरप्रवाह दर दो स्वतंत्र flowmeters द्वारा नियंत्रित किया जाता है. हवा धाराओं गैस धोने की बोतलों में पानी के माध्यम से गुजर से humidified हो सकता है, हालांकि देखभाल करने पर आर्द्रीकरण से बचने के लिए (यानी ~ 60% से अधिक) से लिया जाना चाहिए कर सकते हैं. माध्यमिक हवा स्ट्रीम या तो एक गंध सिरिंज या एक खाली सिरिंज के माध्यम से निर्देशित है: सीरिंज एक सिरिंज सुई सवार छेदने (1.2 मिमी की बाहरी व्यास) के माध्यम से airflow से जुड़े हैं. एक तीन तरह चुंबकीय एक वाल्व नियंत्रक इकाई (जैसे हार्वर्ड उपकरण VC6) के माध्यम से नियंत्रित वाल्व के लिए स्वच्छ हवा और गंध उत्तेजना के बीच स्विच करने के लिए प्रयोग किया जाता है. 4. में vivo इमेजिंग में हम यहाँ वर्णन इमेजिंग एक ईमानदार फ्लोरोसेंट खुर्दबीन (जैसे ईमानदार निश्चित स्टेज Zeiss Axio परीक्षक डी 1) एक 20x पानी के उद्देश्य (जैसे Zeiss डब्ल्यू "योजना APOCHROMAT / 20x M27 1,0 डीआईसी) (चित्रा 2) के साथ सुसज्जित का उपयोग. जी शिविर (उत्तेजना / उत्सर्जन: 488/509 एनएम) के साथ इमेजिंग के लिए 450-490 एनएम उत्तेजना फिल्टर, निम्नलिखित गुणों के साथ एक फिल्टर ब्लॉक का उपयोग करें:Dichroic दर्पण (T495LP) और 500-550 एनएम उत्सर्जन फिल्टर (क्रोमा एट). बढ़ते खुर्दबीन के नीचे उड़ युक्त ब्लॉक रखें. मक्खी एंटीना के सामने olfactometer लगभग 0.5 सेमी की स्थिति से बाहर निकलें. उद्देश्य कम जब तक यह है मक्खी के सिर पर घंटी के समाधान को छू लेती है. दर्शक के माध्यम से उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के अंतर्गत, तैयारी की स्थिति तो यह है कि सिर कैप्सूल में छेद केंद्रित है और अपनी सीमाओं को ध्यान में देख रहे हैं. फ्लोरोसेंट रोशनी के लिए स्विच और ध्यान समायोजित जब तक आप लेबल न्यूरॉन्स जी शिविर के बेसल हरी प्रतिदीप्ति से स्पष्ट देख सकते हैं. एक आरोप डिवाइस युग्मित के साथ छवियों को प्राप्त करने से ब्याज की ग्लोमेरुली पर ठीक फोकस कैमरा (सीसीडी) (जैसे CoolSNAP HQ2 डिजिटल कैमरा सिस्टम) उपयुक्त अधिग्रहण (जैसे Metafluor) सॉफ्टवेयर (चित्रा 3) का उपयोग कर खुर्दबीन पर घुड़सवार. रोशनी प्रकाश पथ में डायाफ्राम बंद करने के लिए छवि क्षेत्र उत्तेजना प्रकाश सीमा. रिकॉर्डिंग गंध पैदागतिविधि, 4 हर्ट्ज के अधिग्रहण की दर निर्धारित करने और जोखिम को अपने सीसीडी कैमरा के गतिशील रेंज के भीतर प्रतिदीप्ति मूल्यों को प्राप्त करने के समय को समायोजित, लेकिन नहीं की तुलना में 1000 (मनमाना इकाइयों) कम से कम 12 बिट गतिशील संकल्प के साथ, कम है. जोखिम समय 100 एमएस से अधिक नहीं यदि संभव हो, के लिए जी – शिविर photobleaching को कम करना चाहिए. यदि आपके कैमरे के स्थानिक संकल्प की अनुमति देता है, तो आप binning वृद्धि (चिप है कि एक डिजिटल पिक्सेल में binned जाएगा पर कुओं की संख्या) समय जोखिम को कम कर सकते हैं. हम 350×225 पिक्सल (2×2 की binning साथ), तैयारी में 210×135 माइक्रोन के लिए इसी की छवियों को प्राप्त करते हैं. ये सेटिंग्स अच्छा स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ glomerular जी शिविर की गंध प्रेरित प्रतिक्रियाओं पर कब्जा करते हुए संवाददाता सीमित विरंजन इष्टतम हैं. माप मानकों सेट. हम आम तौर पर 10 सेकंड (यानी 40 फ्रेम) के लिए गंध उत्तेजना अधिग्रहण अवधि की शुरुआत के बाद आमतौर पर 4 सेकंड (15 फ्रेम) शुरू करने और स्थायी एक (दूसरा यू के साथ, रिकॉर्डntil 19 फ्रेम). एक मक्खी तैयारी के साथ सामान्य रूप से परीक्षण कर सकते हैं 25-30 अलग गंध उत्तेजनाओं, अक्सर photobleaching के लिए कारण रिपोर्टर की फ्लोरोसेंट संकेत में एक अपरिवर्तनीय गिरावट के द्वारा सीमित किया जाना है. अंतर – उत्तेजना अंतराल मनाया प्रतिक्रिया की ताकत और photobleaching की दर पर निर्भर करेगा. परीक्षण प्रयोगों में एक सकारात्मक नियंत्रण गंध (अगर जाना जाता है) की प्रस्तुति द्वारा दोहराया अंतर प्रोत्साहन के लिए संवेदी अनुकूलन से बचने के अंतराल के उचित लंबाई लगभग निर्धारित किया जा सकता है. इस गंध के शामिल हर ~ एक दी श्रृंखला में 10 उत्तेजनाओं को जारी रखा व्यवहार्यता और तैयारी के अनुरूप प्रतिक्रिया के सत्यापन की अनुमति कर सकते हैं. 5. डाटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण डेटा (मैक biophotonics प्लग – इन के साथ, ImageJ का उपयोग संसाधित है www.macbiophotonics.ca ) और कस्टम के रूप में लिखा Matlab और अनुसंधान में कार्यक्रम: सही नमूने आंदोलन कलाकृतियों के लिए:सभी एक जानवर (जैसे हर 40 तख्ते के 30 माप) / StackReg TurboReg के कठोर शरीर "मोड (तैयारी का उपयोग करने के लिए इसी छवियों को संरेखित bigwww.epfl.ch / / thevenaz stackreg ImageJ). इस कदम के भीतर और माप के बीच अधिग्रहण फ्रेम करने के लिए सम्मान के साथ लेबल न्यूरॉन्स की स्थिति में बदलाव को हटाने की आवश्यकता है. हालांकि, यह तभी संभव है xy विमान में बदलाव को दूर. अगर ध्यान में मजबूत परिवर्तन होते हैं डेटा खारिज किया जाना चाहिए. व्यक्ति 10 सेकंड (40 फ्रेम) माप में ढेर खंड. कलाकृतियों विरंजन के लिए सही: फ्लोरोसेंट रोशनी के लिए जोखिम के लिए एक एकल 10 माप के दौरान क्षय प्रतिदीप्ति कारण होगा. कुछ मामलों में, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए आंकड़ों का विश्लेषण करने से पहले इस क्षय के लिए सही है. प्रत्येक माप के लिए एक पृष्ठभूमि फ्रेम की गणना. यह प्रोत्साहन शुरुआत (6-14 जैसे फ्रेम) से पहले कई फ्रेम का मतलब होना चाहिए. इस backg द्वारा प्रत्येक फ्रेम विभाजितफ्रेम दौर के सापेक्ष प्रतिदीप्ति परिवर्तन को प्राप्त करने के लिए. जी शिविर से लेबल क्षेत्र के भीतर सभी पिक्सल के औसत से प्रत्येक फ्रेम के लिए मतलब सापेक्ष प्रतिदीप्ति मूल्य की गणना. मतलब प्रतिदीप्ति वक्र के लिए एक डबल घातीय फ़िट, उत्तेजना और गंध प्रतिक्रिया (हमारे मामले में 20 फ्रेम के शुरू होने के बाद प्रोत्साहन) के समय के लिए शून्य वजन से पहले फ्रेम करने के लिए मजबूत वजन दे रही है. प्रत्येक पिक्सेल के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति वक्र से सज्जित वक्र घटाना. पृष्ठभूमि कच्चे डेटा पुनः प्राप्त करने के लिए फ्रेम द्वारा सही फ्रेम गुणा. सुधार की इस तरह की प्रतिक्रिया की गतिशीलता में एक संशोधन के लिए नेतृत्व यदि संकेत माप के अंत (उदाहरण के लिए अगर निरोधात्मक या बहुत मजबूत उत्तेजक प्रतिक्रिया पैदा कर रहे हैं) (चित्रा 4) द्वारा आधारभूत वापस नहीं करता है हो सकता है. जबकि विरंजन कलाकृतियों के सुधार के कई मामलों में उपयोगी है, लौकिक मापदंडों की व्याख्या सावधानी से किया जाना चाहिए अगर एक ब्लीच सुधार के लागू किया जाता है. प्रतिदीप्ति में रिश्तेदार परिवर्तन (और डी की गणनाLTA, (के रूप में प्रत्येक माप की प्रत्येक फ्रेम के लिए / एफ) एफ मैं एफ 0) / एफ 0 * 100, जहां एफ 0 पृष्ठभूमि फ्रेम (5.3 देखें), एफ और मैं मैं वें के फ्रेम के लिए प्रतिदीप्ति मूल्य है माप. 10 गतिविधि निशान (चित्रा 5A) प्राप्त करने के लिए पिक्सल के एक व्यास के साथ एक glomerulus (3B चित्र) में ब्याज की एक परिपत्र क्षेत्र के भीतर मतलब ΔF के / एफ गणना. अगर वांछित है, का उपयोग heatmaps ImageJ (चित्रा 5A) में इन निशान को बदलने. मतलब / प्रतिक्रिया के चोटी के दौरान चार फ्रेम के एफ ΔF से उत्तेजना से पहले चार फ्रेम के मतलब ΔF / एफ subtracting द्वारा प्रतिक्रिया की शिखर आयाम की गणना. एक ही प्रक्रिया दोनों में प्रयोग किया जाता है स्थानिक प्रतिक्रिया पैटर्न (चित्रा 3B देखें) वर्णन और मक्खियों भर में ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों में प्रतिक्रिया आयाम यों (चित्रा 5B देखें). शिखर प्रतिक्रिया भी उत्तेजना के समय, या averagin के दौरान वक्र नीचे क्षेत्र को समेकित करने के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैजी प्रतिक्रिया का अधिकतम चारों ओर फ्रेम. 6. प्रतिनिधि परिणाम हम ऊपर प्रोटोकॉल का इस्तेमाल करने के लिए रिकॉर्ड और मक्खियों के propionic एसिड पैदा प्रतिक्रियाओं घ्राण सह रिसेप्टर IR8a जो 29,30 OSNs के कई अलग अलग आबादी (में सक्रिय है के लिए प्रमोटर के नियंत्रण के तहत 28 जी – CaMP1.6 के व्यक्त विश्लेषण 3-5 आंकड़े). दो ग्लोमेरुली DC4, और DP1l (3B चित्र) innervating OSNs में intracellular कैल्शियम में वृद्धि का संकेत – 1% propionic एसिड के साथ उत्तेजना जी शिविर प्रतिदीप्ति में वृद्धि elicits में. लाइन गतिविधि निशान, heatmaps, और शिखर प्रतिक्रियाओं का एक बार साजिश: हम कई मक्खियों से चित्रा 5 में डेटा का प्रतिनिधित्व करने के विभिन्न तरीकों के उदाहरण देकर स्पष्ट करना. Propionic एसिड पैदा की प्रतिक्रियाएं अलग शिखर DC4 और DP1l में और amplitudes के अस्थायी गतिशीलता है. इसके अलावा, हालांकि प्रतिक्रियाएं आम तौर पर मजबूत कर रहे हैं, व्यक्ति पशुओं के बीच परिवर्तनशीलता दोनों ग्लोमेरुली में भी मनाया जा सकता है (वह देखनाचित्रा 5A में atmaps). शिखर प्रतिक्रियाओं (चित्रा 5 ब) की मात्रा के विभिन्न जानवरों के पार और ग्लोमेरुली अलग odorants के बीच एक सरल सांख्यिकीय तुलना की अनुमति देता है. हालांकि, गंध पैदा कैल्शियम प्रतिक्रियाओं गैर वर्दी अस्थायी गतिशीलता है, कर सकते हैं और एक ही मूल्य के साथ उनके परिमाण बढ़ाता इस जटिलता की उपेक्षा करेंगे. चित्रा 1 बढ़ते ब्लॉक योजनाबद्ध (ए) पहले और (बी) के बाद मक्खी की शुरूआत, और (सी) क्लोज़ – अप में एक शीर्ष दृश्य (31 से अनुकूलित). चित्रा 2 प्रयोगात्मक सेट अप के योजनाबद्ध. चित्रा 3 (ए) 2.8 कदम (बाएं पैनल) और कच्चे प्रतिदीप्ति छवि पूर्व की बाद मक्खी तैयारी के शीर्ष दृश्य.nnal lobes जी – CaMP1.6; जी CaMP1.6: IR8a प्रमोटर यूएएस GAL4 जीनोटाइप के साथ लेबल है. DC4 और DP1l के ग्लोमेरुली उनके आकार, आकृति विज्ञान और स्थिति के द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है और लाल और नीले रंग में चिह्नित कर रहे हैं, क्रमशः. (बी) propionic एसिड (1% v / v) की प्रतिक्रिया की छवि रंग कोडित. छवि / गणना प्रतिक्रिया के रूप में 5.6 कदम में समझाया (चित्रा 5A भी देखें) के शिखर की ΔF एफ से मेल खाती है. बाईं तरफ colorscale% मूल्य / ΔF एफ इंगित करता है. काले हलकों और प्रतिक्रियाओं यों (चित्रा 5) के लिए प्रयोग किया जाता हित के क्षेत्र की स्थिति और आकार का संकेत मिलता है. चित्रा 4 फ्लोरोसेंट संवाददाता संकेत के विरंजन सही. 5.3 चरण में वर्णित के रूप में ब्लीच सुधार के प्रभाव के उदाहरण हैं. बाईं पैनल पर नमूना डेटा प्रतिक्रिया के आकार में बड़े बदलाव के बिना सही किया जा सकता है. सही पैनल पर नमूना डेटा गंभीर रूप से प्रभावित हैब्लीच सुधार, की संभावना से एड क्योंकि संकेत बूँदें और गंध उत्तेजना समाप्ति के बाद आधारभूत नीचे बनाए रखा. चित्रा 5 (ए): DC4 ग्लोमेरुली (बाएं) और (दाएं) DP1l propionic एसिड (1% v / v) की कैल्शियम की प्रतिक्रियाओं के अस्थायी गतिशीलता. काला निशान मतलब के भीतर ΔF एफ / ब्याज की आठ पशुओं में (देखें चित्रा 3B) क्षेत्र की औसत दिखाते हैं. ग्रे सतह वितरण की पहली और तीसरी quartiles के बीच सीमा को इंगित करता है. मंझला और चतुर्थक मान की प्रस्तुति और मतलब है और मानक त्रुटि से मनाया प्रतिक्रियाओं का वितरण परिवर्तनशीलता के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करता है. हरे और मैजंटा बक्से से संकेत मिलता है फ्रेम करने के लिए शिखर प्रतिक्रियाओं चित्रा 3B में दिखाया गया है, और चित्रा 5B में मात्रा गणना का औसत. नीचे: heatmaps अलग पंक्तियों में सभी अलग – अलग जानवरों के लिए प्रतिक्रिया डेटा / ΔF एफ repr मूल्यों के साथ,colorscale (दूर सही) द्वारा esented. क्षैतिज काली सलाखों और उत्तेजना की समय अवधि का संकेत है. (बी) लिए DC4 और DP1l के ग्लोमेरुली आठ पशुओं भर में माध्य शिखर propionic एसिड के लिए प्रतिक्रियाओं. त्रुटि पट्टियाँ वितरण की पहली और तीसरी quartiles के बीच सीमा का संकेत मिलता है.

Discussion

तैयारी और विश्लेषण यहाँ वर्णित तरीकों के लिए है न्यूरॉन्स स्पर्शतंतु संबंधी पालि (OSNs, एलएन और पीएन) में जो के लिए एक संगत ड्राइवर transgene उपलब्ध है की किसी भी जनसंख्या में गंध पैदा प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण किया जा सकता है. जब तक हम एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर अपने आवेदन का वर्णन, इस तैयारी के ऑप्टिकल इमेजिंग समान रूप से ^22,32 माइक्रोस्कोपी confocal या दो photon का उपयोग किया जा सकता है. दरअसल, इन बाद उपकरणों के व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी प्रकाश बिखरने की समस्या है, जो छवियों के संकल्प को कम कर सकते हैं, खासकर जब न्यूरॉन्स व्यक्त की बड़ी संवाददाता संख्या कम. यह तैयारी आम तौर पर कम से कम आधे घंटे के लिए गंध पैदा प्रतिक्रियाओं की रिकॉर्डिंग परमिट, लेकिन इस बार काफी लंबे समय तक या कम दर्ज की माप की संख्या और लंबाई पर निर्भर करता है हो सकता है, जोखिम समय प्रत्येक फ्रेम और अंतराल अंतर प्रोत्साहन के लिए इस्तेमाल किया. इसके अलावा, दो photon उत्तेजना को कम कर सकते हैं फ्लोरोसेंट प्रतिनिधि के photobleachingorter के, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेलुलर phototoxicity, लंबे समय ^22,32 अवधि से अधिक माप करने की अनुमति.

माइक्रोस्कोप की पसंद के बावजूद, सिर कैप्सूल के भीतर मक्खी के मस्तिष्क के आंदोलन सबसे आवर्तक समस्या है जब बरकरार पशुओं में इमेजिंग. जबकि आंदोलन सुधार के छोटे मुद्दों (5.1 कदम) को सही कर सकते हैं, यह बेहतर आमतौर पर केवल अत्यधिक स्थिर तैयारी से रिकॉर्ड है. आंदोलन कलाकृतियों को कम करने के लिए रणनीतियाँ शामिल हैं: (i) ठीक कैक्टस रीढ़ की हड्डी के साथ मक्खी की सूंड में बाधा, (ii) मंच पर उन्हें eicosane (पूर्व 2.6 कदम के लिए) (eicosane पर पिघल जा सकता है के साथ फिक्सिंग से उड़ पैर immobilizing ~~ 37 डिग्री सेल्सियस, एक चांदी का तार का उपयोग का विस्तार करने और इस प्रयोजन के लिए टांका लगाने का यंत्र) की नोक को परिष्कृत; (iii) ठीक चिमटी के साथ घुटकी (स्पर्शतंतु संबंधी नसों के बीच दिखाई दे) nicking.

यहां इस्तेमाल किया जी CaMP1.6 अलावा, जी शिविर और अन्य कैल्शियम संकेतक के अनुकूलित संस्करण का एक संख्या में उपलब्ध हैं,जो उनके संकेत से शोर अनुपात, आधारभूत प्रतिदीप्ति और अस्थायी ^12,28,33 गतिशीलता में अलग. सेंसर की सटीक पसंद खाते में इन गुणों के सभी न्यूरॉन्स के प्रकार का विश्लेषण किया जा करने के लिए और जैविक सवाल संबोधित किया जा रहा रखना चाहिए. वर्तमान सेंसर कैल्शियम परिवर्तन है कि कार्रवाई ^12,34 क्षमता है, और उनके आगे सुधार के साथ काफी अच्छी तरह से सहसंबंधी, विशिष्ट आनुवंशिक ड्राइवर के ³⁵ लाइनों की बढ़ती संख्या के साथ युग्मित की रिपोर्ट बरकरार मक्खी में तंत्रिका गतिविधि के ऑप्टिकल इमेजिंग की क्षमता बढ़ाने के लिए जारी रहेगा.

Materials

Reagent	Supplier	Catalogue number	Comments
Cactus spine	Garden center		~7mm long thin, not too flexible
Rosin	String instrument shop
Two component silicon	WPI	KWIK-SIL
Custom made plexiglass mounting block	Blueprints available from http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/
Copper grids	Athene Grids	G220-5	Normally used for electron microscopy samples.
Screws	Hardware store		2 mm diameter
Plastic coverslips	Plano-em	L4193	22 X 22 mm
Soldering iron tips	Conrad Electronics	830283-62
Regulated power supply	Conrad Electronics	511407-62
Thin wire	Isabellenhütte	Isa-ohm	0.013 mm
Eicosane	Sigma	21,927-4
Microscope	Zeiss	Axioexaminer D1
CCD camera	Visitron	CoolSnap HQ
Metafluor	Visitron		Acquisition software
Monochromator	Visitron	Visichrome
Breakable blades	Fine Science Tools	10050-00
Holder for blade	WPI	14134
Sapphire blade	WPI	500314	Double edged blade 1mm
Membrane gas pumps	KNF Neuberger AG	NMP 830 KVE
Sapphire blade holder	WPI	500317
Three way valve	Lee Company	LFAA1200118H	Configuration E
Rotameter 500 ml/min	Analyt-MTC	112-08SA
Rotameter 5 L/min	Analyt-MTC	102-08SA
Beeswax	Siladent Technik	209212
Cellulose pad	Kettenbach Medical	31003
Tweezers	Plano-em	T5130	Dumont biology #5
Syringes	BD	300928	2ml, Discardit II, 2pieces
Needles	Braun Sterican	4665120	1.2mm OD