Este documento muestra los métodos para el aislamiento, purificación y detección de exosomas, así como las técnicas para el análisis de su contenido molecular. Estos métodos son adaptables para el aislamiento exosoma de ambos medios de cultivo de células y fluidos biológicos, y puede más allá del análisis de contenido molecular también ser útil en los estudios funcionales.
El campo de la investigación exosoma se está expandiendo rápidamente, con un aumento dramático en las publicaciones en los últimos años. Estas pequeñas vesículas (30-100 nm) de origen endocítica se propuso por primera vez de funcionar como una forma de reticulocitos para erradicar el receptor de transferrina, mientras que en los eritrocitos de maduración 1, y fueron nombrados después exosomas. Exosomas se forman por gemación interna de la tarde endosomes, la producción de cuerpos multivesiculares (MVBs), y se liberan en el medio ambiente por la fusión de la MVBs con la membrana plasmática 2. Desde el primer descubrimiento de exosomas, una amplia gama de células se ha demostrado que la liberación de estas vesículas. Exosomas también se han detectado en varios fluidos biológicos, como el plasma, el líquido lavado nasal, saliva y leche materna 3-6. Además, se ha demostrado que el contenido y la función de exosomas depende de la célula de origen y las condiciones en que se producen. Una variedad de funciones han sido los demoniosconcentrada de exosomas, tales como la inducción de tolerancia frente a alergenos 7,8, la erradicación de tumores establecidos en ratones 9, la inhibición y la activación de las células asesinas naturales 10-12, la promoción de la diferenciación en las células T reguladoras 13, la estimulación de la proliferación de células T 14 y la inducción de la apoptosis de las células T 15. Año 2007 se demostró que los exosomas liberados de los mastocitos contienen ARN mensajero (ARNm) y microRNA (miRNA), y que el ARN puede ser trasladado de una celda a otra a través de exosomas. En las células receptoras, el ARNm transportados por exosomas ha demostrado ser traducido a proteínas, lo que sugiere una función reguladora de la ARN transferido 16. Además, también hemos demostrado que los exosomas derivados de las células cultivadas en el estrés oxidativo puede inducir tolerancia frente al estrés adicional en las células receptoras y por lo tanto sugieren una función biológica de la lanzadera exosomal ARN 17. Medios de cultivo celular y co fluidos biológicosntain una mezcla de vesículas y arrojar fragmentos. Un método de aislamiento de alta calidad para los exosomas, seguido por la caracterización e identificación de los exosomas y su contenido, por lo tanto, es crucial distinguir exosomas de otras vesículas y partículas. A continuación, presentamos un método para el aislamiento de los exosomas de ambos medios de cultivo de células y fluidos corporales. Este método de aislamiento se basa en la centrifugación repetida y etapas de filtración, seguida de una etapa ultracentrifugación final en el que los exosomas se precipitan. Métodos importantes para identificar los exosomas y caracterizar la morfología exosomal y contenido de proteína se ponen de relieve, incluso la microscopia electrónica, citometría de flujo y Western blot. La purificación del RNA exosomal total se basa en la cromatografía de columna de giro y el rendimiento exosomal ARN y distribución de tamaño se analizaron mediante un Bioanalyzer.
Al estudiar el contenido molecular y / o la función de los exosomas, es fundamental utilizar un método de aislamiento de alta calidad que proporciona un rendimiento adecuado y el grado más bajo posible de la contaminación. La metodología descrita en este trabajo es un enfoque bien establecido para aislar los exosomas y estudiar su contenido de ARN y función biológica. Por otra parte, la importancia de la caracterización de los exosomas aislados, por una combinación de diferentes métodos, incluyendo la microscopía electrónica, citometría de flujo y Western blot, se pone de relieve.
Al aislar los exosomas, en la primera centrifugación (300 xg) se utiliza para precipitar las células que pueden estar presentes en la suspensión de células o el líquido estudiado biológica. La segunda centrifugación a 16 500 xg necesita ser lo suficientemente fuertes para precipitar las células muertas, escombros más grandes, cuerpos apoptóticos y otros organelos. Después de la centrifugación, algunos protocolos incluyen una etapa de nanofiltración, pero algunos investigators han excluido a este paso. Sin embargo, hacemos hincapié en la importancia de los fragmentos de la erradicación y de las vesículas de más de 200 nm, por lo que recomendamos como una etapa de filtración. Si un aislamiento más estrictas que se necesita, a 100 nm filtros se pueden utilizar, pero tenga en cuenta que si se utilizan fluidos viscosos, estos filtros pueden obstruirse y material exosomal se pierde. Además, un sistema de filtración de 100 nm puede afectar a la morfología de los exosomas y, además, si exosomas son a mayor escala que se pueden perder. Por lo tanto, los 200 nm filtros parece apropiado para el aislamiento exosoma. Después de la filtración, la ultracentrifugación obligatoria a 120.000 xg se utiliza para que sedimenten las exosomas. Los exosomas se pueden seguir lavadas con PBS, unida a las microesferas recubiertas de anticuerpo y se lavó, o colocado en un gradiente de sacarosa para eliminar las proteínas contaminación. Sin embargo, esto puede ser un proceso muy lento de los recursos que sostienen que no es necesario, especialmente si el volumen de la muestra inicial es pequeña y / o el contenido de ARN of los exosomas es baja, como medidas adicionales disminuirá sustancialmente el material adicional. Sin embargo, una vez más, la naturaleza de las vesículas aisladas deberían ser probadas por la presencia y la ausencia de ciertas proteínas.
Hasta la fecha, ningún marcador de proteínas absolutamente único de los exosomas ha sido identificado para verificar que la muestra contiene exosomas y nada más. Como resultado, una combinación de métodos son necesarios para caracterizar los exosomas, incluida la determinación del tamaño y la morfología de los exosomas por microscopía electrónica. Además, la pureza de la muestra se puede determinar mediante microscopía electrónica, ya que este método puede proporcionar una visión general del nivel de contaminación de la muestra, por ejemplo, con grandes vesículas, como por ejemplo micropartículas, cuerpos apoptóticos o restos celulares. Además, el contenido proteico de los exosomas se puede determinar por citometría de flujo y Western blot, y la combinación de estos dos métodos da como resultado un análisis tanto de la unida a la membrana (por ejemplo, CD63 yCD81) e internalizado las proteínas (por ejemplo, Tsg101 y Alix) de los exosomas. Detección de proteínas enriquecido en los exosomas, como CD63, Tsg101 y Alix, y la ausencia de proteínas tales como el retículo endoplasmático proteína calnexina, es una indicación de que el exosoma pellet enriquecido es de hecho exosomas y no contaminar las vesículas de los otros compartimientos de la célula.
El perfil de los ARN que se detecta en los exosomas es fundamentalmente diferente a la del ARN que se encuentran en las células intactas. Por lo tanto, el ARN exosomal analizados por Bioanalyzer o en gel a base de los enfoques de análisis de ARN carecen de los dos picos del 18S y 28S rRNA subunidades, que ocupan un lugar destacado en el análisis del ARN celular. Por lo tanto, argumentan que la detección de cantidades significativas de rRNA en una muestra indica que el ARN total extraído no es de origen exosomal solo, y por lo tanto que el método de aislamiento es necesario mejorar la calidad y la seguridad.
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue financiado por el Consejo Sueco de Investigación (K2008-57X-20 676-01-3).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Exosome isolation | |||
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 65670 | |
Quick-seal ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776) | |
Quick-Seal Cordless Tube Topper kit | Beckman Coulter | 358312 | |
Filtropur Syringe Filter, 0.20μm | Sarstedt | 83.1826.001 | For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600). |
Electron microscopy | |||
Formvar/carbon coated nickel grids | Ted Pella Inc | 1GN200 | |
Mouse-anti-human CD63 | BD Bioscience | 556019 | Final conc: 0.05μg/μl |
Isotype control; IgG1κ (MOPC 21) | Sigma-Aldrich | M9269 | Final conc: 0.05μg/μl |
Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm | Sigma-Aldrich | G7777 | Final conc: 1% |
LEO 912AB Omega Electron microscope | Carl Zeiss NTS | Or equivalent equipment. | |
Flow cytometry | |||
4μm aldehyd/sulphate latex beads | Interfacial Dynamics | 12-4000 | |
Antibody for coating of the latex beads | For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019) | ||
Intelli-Mixer RM-2L | ELMI | Or equivalent equipment. | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich | I4506 | |
Antibodies for detection | BD Bioscience | For example: PE anti-CD63 (556020) PE anti-CD9 (555372) PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749) | |
BD FACSAria | BD Bioscience | ||
Western Blot | |||
Transsonic T 490 DH | ELMA | Or equivalent equipment. | |
Isolation of exosomal RNA and RNA analysis | |||
miRCURY RNA Isolation Kit | Exiqon A/S | 300110 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939A |