अनुकूलित Mycoplasma के पीसीआर आधारित डिटेक्शन

Summary

Lookout Mycoplasma पीसीआर जांच किट पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), जो सेल संस्कृतियों और अन्य सेल जैव व्युत्पन्न संस्कृति में Mycoplasma, Acholeplasma और Ureaplasma संदूषण का पता लगाने के में उच्चतम संवेदनशीलता के लिए पसंद की विधि के रूप में स्थापित है का इस्तेमाल.

Abstract

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.

The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.

PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per μl. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.

Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

Protocol

1. Mycoplasma जांच सेल संस्कृति supernatants सीधे परीक्षण किया जा सकता है या एक बाद की तारीख में उपयोग के लिए नमूना तैयार कर सकते हैं. के लिए तैयार बाद में एक बाँझ प्रवर्धन ट्यूब और सेते में 95 में जगह सतह पर तैरनेवाला के 100 μl डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए उपयोग एक बार यह पूरा नमूना 2-8 ° सी में एक सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है. बस से पहले नमूना संक्षिप्त गोली (5 सेकंड) अपकेंद्रित्र किसी भी सेलुलर मलबे चलाने के लिए. पीसीआर के लिए नमूने तैयार करने के लिए, जम्पस्टार्ट Taq डीएनए पोलीमरेज़ / पुनर्जलीकरण प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक बफर की कुल मात्रा का निर्धारण. हम 5 कुल प्रतिक्रियाओं की तैयारी हो जाएगा. पांच प्रतिक्रियाओं Taq के 2.5μl और पुनर्जलीकरण बफर के 114.5μl की आवश्यकता होगी. यह एक इकाई के प्रति प्रतिक्रिया और नमूना प्रतिक्रिया और नकारात्मक से अधिक सकारात्मक नियंत्रण के लिए पुनर्जलीकरण बफर के 24.5μl नियंत्रण के प्रति पुनर्जलीकरण बफर के 22.5μl Taq के एक न्यूनतम में शामिल होंगे. प्रतिक्रिया प्रति डीएनए पोलीमरेज़ की 1 यूनिट पुनर्जलीकरण बफर का उचित मात्रा में जोड़ा जाना चाहिए. यह प्रयोग किया जाता Taq के साथ अलग अलग होंगे. एक साफ microcentrifuge ट्यूब में Taq डीएनए पोलीमरेज़ की गणना मात्रा प्लेस और पुनर्जलीकरण बफर की गणना की मात्रा के साथ पालन करें. डीएनए बफर / पोलीमरेज़ पुनर्जलीकरण ट्यूब flicking द्वारा धीरे मिलाया जाना चाहिए. इस मिश्रण vortexed नहीं होना चाहिए. नकारात्मक नियंत्रण तैयार करने के लिए और नमूने पारदर्शी प्रतिक्रिया किट में दिए गए ट्यूबों का उपयोग करें. प्रतिक्रिया किट में प्रदान की ट्यूब को पहले से ही nuclueotides, प्राइमरों और आंतरिक नियंत्रण डीएनए होते हैं. जम्पस्टार्ट Taq डीएनए बफर पोलीमरेज़ पुनर्जलपूरण / मिश्रण, के रूप में पिछले चरणों में तैयार की 23 μl नकारात्मक नियंत्रण और नमूना ट्यूबों के प्रत्येक में रखा जाना चाहिए. नकारात्मक नियंत्रित करने के लिए डीएनए मुफ्त पानी के 2 μl जोड़ें और नमूना ट्यूब और लेबल के प्रत्येक नमूना के 2 μl जोड़ने. ट्यूबों flicking द्वारा सामग्री का मिश्रण. सामग्री vortexed नहीं होना चाहिए. तैयार करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण गुलाबी प्रतिक्रिया किट में प्रदान ट्यूबों का उपयोग करें. प्रतिक्रिया किट में प्रदान की ट्यूब को पहले से ही nuclueotides, प्राइमरों और आंतरिक नियंत्रण डीएनए होते हैं. प्रतिक्रिया ट्यूबों और लेबल के लिए जम्पस्टार्ट Taq डीएनए बफर / पोलीमरेज़ पुनर्जलपूरण मिश्रण के 25 μl, के रूप में पिछले चरणों में तैयार जोड़ें. ट्यूबों flicking द्वारा सामग्री का मिश्रण. सामग्री vortexed नहीं होना चाहिए. नकारात्मक नियंत्रण, सकारात्मक नियंत्रण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नमूना ट्यूबों सेते हैं. के लिए पीसीआर जगह लेने के लिए नमूने के लिए एक थर्मल cycler में रखा जाना चाहिए. जब जम्पस्टार्ट Taq का उपयोग कर एक सक्रियकरण कदम की आवश्यकता नहीं है. थर्मल cycler में प्रतिक्रिया ट्यूबों रखें. चक्र के रूप में सेट किया जाना चाहिए: 94 ° C 30 सेकंड के लिए, 55 ° सी के लिए 30 सेकंड और 40 सेकंड के लिए 72 ° सी. ये चक्र 40 बार चलाया जाएगा. एक बार पीसीआर चक्र पूरा कर लिया है नमूनों उन्हें थर्मल cycler से हटाने और उन्हें बर्फ में रखकर 4-8 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाना चाहिए. जब नमूने ठंडा है वे agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए पर लोड किया जाना चाहिए. लोड हो रहा है जेल और डाई के लिए आवश्यक के रूप में वे पहले से ही कर रहे हैं प्रतिक्रिया ट्यूबों में मौजूद नहीं हैं. सीधे प्रत्येक पीसीआर के लिए एक अलग लेन में 8 μl लोड. 3.0 सेमी – 2.5 के प्रवास के बाद वैद्युतकणसंचलन बंद करो. 2. प्रतिनिधि परिणाम नकारात्मक नियंत्रण लगभग 481 बीपी पर एक बैंड दिखाने चाहिए. यह है कि वीडियो की शुरुआत में दिखाया गया है वैद्युतकणसंचलन जेल पर नकारात्मक नियंत्रण स्तंभ में देखा जा सकता है. 481 बीपी पर नकारात्मक नियंत्रण बैंड के अभाव में एक अच्छा संकेत है कि पोलीमरेज़ की गतिविधि sufficienttaq काफी संवेदनशील नहीं था नहीं था है. Mycoplasma सकारात्मक नमूनों बैंड 270 की रेंज में ± 8 बीपी दिखाएगा. बैंड अत्यधिक प्रदूषित नमूनों के लिए भारी और हल्के ढंग से दूषित नमूने के लिए बेहोश हो जाएगा. तीव्रता में बदलाव वैद्युतकणसंचलन जेल पर सकारात्मक नमूना स्तंभों है कि वीडियो की शुरुआत में दिखाया गया है में देखा जा सकता है. सभी नमूनों को एक आंतरिक नकारात्मक नियंत्रण को दिखाना है कि पीसीआर हुई उम्मीद के रूप में होते हैं. यह अत्यधिक प्रदूषित नमूनों पर आंतरिक नियंत्रण के अभाव देखने के लिए सामान्य है. यदि सकारात्मक या नकारात्मक रेंज में अपने नमूना पर एक बैंड रेंज में एक बैंड नहीं है यह एक अच्छा संकेत है कि अपने नमूनों हिचकते हैं. यदि नमूना हिचकते है पीसीआर inhibitors एक डीएनए निष्कर्षण प्रदर्शन से हटाया जा सकता है है. . चित्रा 1 प्रासंगिक Amplicon बैंड: पीसीआर द्वारा mycoplasma का पता लगाने के परिणाम दिखाए गए हैं. 2 लेन नकारात्मक नियंत्रण है, जो लगभग 481 बीपी पर एक बैंड दिखाने चाहिए. 481 बीपी पर नकारात्मक नियंत्रण बैंड के अभाव में एक अच्छा संकेत है कि Taq प्रयोग किया जाता काफी संवेदनशील नहीं था है. Mycoplasma सकारात्मक नमूने 270 की रेंज में बैंड दिखाने + 8 के रूप में 3 गलियों में दिखाया बीपी जाएगा – 6. बैंड hea जाएगाvy अत्यधिक प्रदूषित (6 लेन) नमूने और हल्के ढंग से दूषित नमूने (4 लेन) के लिए बेहोश के लिए. सभी नमूनों को एक आंतरिक नकारात्मक (481 बीपी) को नियंत्रित करने के लिए दिखाना है कि पीसीआर हुई उम्मीद के रूप में होते हैं. यह अत्यधिक प्रदूषित नमूनों पर आंतरिक नियंत्रण के अभाव देखने के लिए सामान्य है.

Discussion

किट की अति संवेदनशीलता की वजह से, जब सही ढंग से प्रदर्शन किट सटीक संकेत है चाहे या नहीं अपने नमूना mycoplasma संदूषण परिणाम उपज चाहिए. किट जम्पस्टार्ट Taq डीएनए पोलीमरेज़ के साथ प्रयोग के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है. अन्य taqs जब नमूनों की तैयारी में इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन 481 बीपी पर आंतरिक नियंत्रण बैंड वैकल्पिक Taq के समुचित संवेदनशीलता का संकेत मौजूद होना चाहिए. यह संभव है के लिए सकारात्मक बैंड विभिन्न संदूषण के स्तर पर निर्भर करता है घनत्व प्रदर्शन के लिए. यह भारी दूषित नमूनों पर आंतरिक नियंत्रण बैंड के अभाव का पालन करने के लिए संभव है. सतर्कता और उचित तकनीक का प्रयोग जब नमूने की तैयारी के लिए प्रदूषण को रोकने के उचित के लिए महत्वपूर्ण हैं. पता लगाने जब तलाश Mycoplasma पीसीआर जांच किट का उपयोग कर.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit	Sigma-Aldrich	MP0035
JumpStart Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D9307
GenElute Blood Genomic DNA kit	Sigma-Aldrich	MP0030
Nunc amplification tubes	Sigma-Aldrich	T0447