En attraktiv modell för att studera differentiering stamceller i ett levande djur är planarian plattmask. Regenerering studeras med enkla amputation experiment som enkelt kan utföras i ett grundläggande laboratorium och kan bli föremål för farmakologiska och genetiska (<em> In vivo</em> RNAi) manipulation som beskrivs av protokoll i denna artikel.
Fritt levande planarian Plattmaskar har en lång historia av experimentell användning på grund av deras märkliga regenerativ förmåga 1. Små fragment censurerade från dessa djur reformera den ursprungliga kroppen planen, efter förnyelse av saknade kroppens strukturer. Till exempel om en "stam" fragment är gjord av ett intakt mask, en ny "chef" kommer regenerera anteriorly och en "svans" att regenerera posteriort återställa den ursprungliga "head-to-tail" polaritet av kroppens strukturer före amputation (Figur 1A).
Regenerering styrs av planarian stamceller, så kallade "neoblasts" som differentieras till ~ 30 olika celltyper under normal kropp homeostas och verkställas vävnadsregenerering. Detta regenerativ process är robust och lätt att demonstrera. På grund av invigningen av flera banbrytande Labs, många verktyg och funktionella genetiska metoder har nu optimerats för denna modell system. Därför har avsevärda senaste framsteg gjorts i att förstå och manipulera de molekylära händelser som ligger till grund planarian utvecklande plasticitet 2-9.
Det planarian Modellen systemet kommer att vara av intresse för ett brett spektrum av forskare. För neuroforskare, ger modellen möjlighet att studera förnyelse av hela nervsystemet, snarare än bara återväxt / reparation av enstaka nervceller process som vanligtvis står i fokus för studien i många etablerade modeller. Planarians uttrycka en uppsjö av signalsubstanser 10, utgör ett viktigt system för att studera utvecklingen av det centrala nervsystemet 11, 12 och har beteendestörningar screening potential 13, 14.
Regenerativ utfall kan bli föremål för manipulation av farmakologiska och genetiska apparoaches. Till exempel kan läkemedel screenas för effekter på förnyelse genom att helt enkelt placera kroppen fragment i läkemedelsutveckling lösningar som innehåller vid olika tidpunkter efter amputation. Den roll enskilda gener kan studeras med ÖVERVÄLDIGANDE metoder (in vivo RNAi), vilket kan uppnås antingen genom cykler av mikroinjektion eller utfodras bacterially-uttryckta dsRNA konstruerar 8, 9, 15. Båda metoderna kan producera visuellt slående fenotyper vid hög penetrans, till exempel upprustning av bipolär djur 16-21. För att underlätta införandet av denna modell och genomförandet av sådana metoder, visa vi i detta protokoll videon artikeln för farmakologiska och genetiska tester (in vivo RNAi genom att mata) med planarian Dugesia japonica.
De protokoll som beskrivs här ingående analyser för att studera och manipulera förnyelse av planarian Dugesia japonica. De är enkla och inte kräver specialiserad utrustning så att de lätt kan utföras i laboratoriet eller i klassrummet. Analyser kan utföras individuellt eller i kombination (för kemisk genetisk screening av läkemedel effektivitet i vivo) och kan utföras på den kandidat gennivå, eller är anpassningsbara till objektiva, högre throughput screening 8. Vare sig för att studera spännande biologi planarians i sin egen rätt, eller för att bedöma in vivo-funktionen av däggdjur homologer i en alternativ modell för att studera vävnadsregenerering, bör dessa metoder katalysera intresse från en rad olika forskare.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet i labbet stöds av NSF (MCB0919933) och NIH (GM088790).
Reagent | Vendor | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Spring water | Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN | n/a | Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays. |
1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C. | Multiple vendors | n/a | Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative. |
2xYT Broth | Fisher Scientific | BP2467-500 | Media = 31 g/L . Autoclaved. |
Petri Dish (100x25mm) | Fisher Scientific | 08-757-11 | Housing worms during regeneration cycles |
Square Dish (100x100x15mm) | Fisher Scientific | 08-757-11A | Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface |
Plastic tub: Ziploc Twist ‘n Loc (16oz). | Various retailers | n/a | Convenient water tight containers for RNAi cohorts |
Chicken Liver | Commercial grocery | n/a | Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics. |
Hand Blender | Any kitchen supplier | n/a | Use for making chicken liver puree |
Wire 1mm Mesh strainer | Any kitchen supplier | n/a | Use for straining chicken liver puree |
Bovine red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7240807 | 100% Washed and pooled RBC suspension |
Circular filter papers | Whatman #3 | 1003 055 | |
Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-41 | |
Sterile, surgical blades | Multiple Vendors | n/a | |
±Praziquantel | Sigma Aldrich | P4668 | Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate. |
Dj-six-1 | GenBank AJ557022.1 | RNAi positive control for “eye-less” phenotype23 | |
Dj-βcatenin-1 | GenBank AB181913.1 | RNAi positive control for two-headed phenotype17 | |
Dj-PC2 | RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24 |