Reconstituição bioquímica de receptor de esteróide • Hsp90 Complexos de Proteínas e Reativação da ligação do ligando
Summary
Um<em> In vitro</em> Método para preparar receptor glicocorticóide funcional (GR) • hsp90 complexos de proteína purificada a partir de proteínas e lisados celulares é descrito. O método utiliza de imunoadsorção recombinante GR seguido de sal de extracção e reconstituição de proteínas complexas. A importância da co-fatores e condições de buffer são discutidos, assim como as aplicações método potencial.
Abstract
Hsp90 é uma proteína chaperone essenciais e muito abundantes molecular que foi encontrado para regular a mais de 150 eucarióticas proteínas sinalizadoras, incluindo fatores de transcrição (por exemplo, receptores nucleares, p53) e proteínas quinases (por exemplo, Src, Raf, Akt cinase) envolvidas no ciclo celular, tumorigênese, apoptose e sinalização 1,2 múltiplos eucarióticas caminhos. Muitos desses 'cliente' proteínas para hsp90, a montagem de receptores de esteróides • hsp90 complexos é o melhor definidos (Figura 1). Nós apresentamos aqui um receptor adaptável glicocorticóides (GR) ensaio de imunoprecipitação e in vitro GR • O método de reconstituição hsp90 que pode ser facilmente utilizado para investigar a atividade hsp90 eucarióticas funcional, hsp90 mediada ligante receptor esteróide vinculativo, e os requisitos de cofactor molecular acompanhante. Por exemplo, este ensaio pode ser usado para testar hsp90 requisitos cofactor e os efeitos da adição de compostos exógenos ao processo de reconstituição.
O GR foi um sistema particularmente útil para estudar hsp90 porque o receptor deve ser ligado a hsp90 de ter uma ligação do ligante fenda aberta que é acessível a 3 de esteróides. GR, endógena unliganded está presente no citoplasma de células de mamíferos não covalentemente ligado a hsp90. Como encontrado no GR endógena • heterocomplex hsp90, a ligação do ligante GR fenda está aberto e capaz de esteróides vinculativo. Se hsp90 se dissocia do GR, ou se a sua função é inibida, o receptor é incapaz de ligar esteróides e requer a reconstituição do GR • heterocomplex hsp90 antes da atividade de ligação de esteróides é restaurado 4. GR pode ser immunoprecipitated do citosol da célula usando um anticorpo monoclonal, e proteínas como a hsp90 complexado ao GR podem ser analisadas por western blot. Actividade de ligação de esteróides do GR immunoprecipitated pode ser determinada incubando a immunopellet com [3 H] esteróides.
Experimentos anteriores mostraram hsp90 mediada abertura da ligação do ligante GR fenda requer hsp70, um segundo chaperone molecular também essencial para a viabilidade das células eucarióticas. Atividade bioquímica de hsp90 e hsp70 são catalisadas por co-chaperone Hop proteínas, hsp40 e p23 5. A acompanhante máquinas multiprotein contendo hsp90, Hop, hsp70, hsp40 e são endogenamente presentes no citoplasma de células eucarióticas, e lisado de reticulócitos fornece um acompanhante rica fonte de proteínas 6.
No método apresentado, GR é imunoadsorvido do citosol celular e despojado da máquina chaperone endógena hsp90/hsp70 usando condições sal leve. O GR-sal despojado é então incubadas com lisado de reticulócitos, ATP e K +, o que resulta na reconstituição do GR • heterocomplex hsp90 e reativação da atividade de ligação de esteróides 7. Este método pode ser utilizado para testar os efeitos de vários cofatores acompanhante, novas proteínas e inibidores experimental hsp90 ou GR, a fim de determinar a sua importância funcional no hsp90 mediada por esteróides 11/08 vinculativo.
Protocol
Discussion
O ensaio descrito acima pode ser adaptado para testar uma miríade de condições que afetam as ações chaperone da máquina chaperone hsp90/hsp70-based bem como GR ligação de esteróides. É uma modificação dos métodos previamente relatado 4,8,9,17 e é projetado para tirar vantagem dos avanços recentes em tecnologia de eletroforese e ser acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa. Cofatores adicionais ou proteínas de interesse pode ser adicionado ao GR • hsp90 mistura reconstituição hete…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health conceder GM086822, Coração Esperança Instituto Básico de Ciências prêmio, eo MJ Murdock Charitable Confiança Colégio Programa de Pesquisa em Ciências. Selecione reagentes eletroforese e software de análise de imagem foram generosamente fornecidos pela Bio-Rad.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Applied Science | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce/Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer | NET1192001MC | follow safety precautions |
References
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