En knacka läge atomkraftsmikroskop (AFM) metod för visualisering av plasmid-DNA, cytoplasma proteiner och DNA-protein komplex beskrivs. Metoden innehåller alternativa metoder för att förbereda prover för AFM bildhantering följande biokemiska manipulation. DNA innehåller specifika regioner protein interagerar observeras i nära fysiologiska bufferten förhållanden.
Atomkraftsmikroskopi (AFM) gör det möjligt att visualisera enskilda proteiner, molekyler DNA, protein-protein komplex, och DNA-protein komplex. På slutet av mikroskop är fribärande är en nanonivå sond, som korsar bild allt från nanometer till mikrometer, mäta höjd av makromolekyler vilar på underlaget ytan vid en given punkt. Elektrostatiska krafter orsakar proteiner, lipider och nukleinsyror att löst fästa på substratet slumpmässiga riktlinjer och tillåter avbildning. De data som genereras likna en topografisk karta, där makromolekyler lösa som tredimensionella partiklar av diskret storlek (Figur 1) 1,2. Knacka läge AFM innebär upprepade svängning cantilever som tillåter avbildning av relativt mjuk biomaterial såsom DNA och proteiner. En av de viktiga fördelarna med AFM jämfört med andra nanoskala mikroskopitekniker är dess relativa anpassningsförmåga att visualisera enskilda proteiner och makromolekylära i vattenlösning buffertar, inklusive nästan fysiologiska buffrade förhållanden, i realtid, och utan färgning eller beläggning det prov som skall avbildas.
Den metod som presenteras här beskriver avbildning av DNA och en immunoadsorbed transkriptionsfaktor (dvs glukokortikoidreceptorn, GR) i buffrad lösning (Figur 2). Immunoadsorbed proteiner och protein kan skiljas från immunoadsorbing antikropps-pärla pellet av konkurrensen med antikroppen epitop och sedan avbildade (Figur 2A). Detta möjliggör för biokemiska manipulation av biomolekyler av intresse innan avbildning. När renat kan DNA och proteiner blandas och den resulterande samverkande komplexa kan avbildas också. Bindning av DNA till glimmer kräver en divalent katjon 3, som Ni 2 + eller Mg 2 +, som kan läggas till prov buffertar ändå behålla protein aktivitet. Med hjälp av en liknande strategi har AFM använts för att visualisera enskilda enzymer, inklusive RNA-polymeras 4 och en reparation enzymet 5, bunden till enskilda DNA-strängar. Dessa experiment ger betydande insikt i protein-protein och DNA-protein biofysiska interaktion som sker på molekylär nivå. Imaging enskilda makromolekylära partiklar med AFM kan vara användbart för att avgöra partikel homogenitet och för att identifiera den fysiska placeringen av ingående komponenter i avbildade partiklar. Samtidigt som den nuvarande metoden utvecklades för visualisering av GR-förkläde proteinkomplex 1,2 och DNA-strängar som GR kan binda, kan den tillämpas allmänt för att avbildning DNA och prover protein från olika källor.
AFM ger en unik mikroskopisk teknik kan imaging obestruket enskilda biomolekyler i vattenlösning och nära fysiologiska buffrade lösningar i realtid. Detta gör det möjligt för visualisering av enskilda proteiner och molekyler DNA, liksom komplex Multiproteinkomplex och protein-DNA-komplex. Imaging makromolekylära partiklar med AFM kan vara användbart för att bedöma prov homogenitet och för att identifiera den fysiska placeringen av de ingående komponenterna i de observerade partiklarna. Denna metod att observera enskilda makromolekylära partiklar kan vara ett bra komplement till konventionella biokemiska tekniker, såsom immunoprecipitation analyser, polyakrylamidgelelektrofores och storlek utanförskap kolonnkromatografi, vilket ger betydande summativ uppgifter som representerar 10 3 -10 11 individuella biomolekylära komplex av intresse närvarande i ett prov.
Forskning Multiproteinkomplex komplexa stökiometri, interaktioner biomolekyler och krav kofaktor alla kan undersökas med hjälp av AFM. Metoden som presenteras här kan anpassas till specifika biofysiska frågor av intresse. Till exempel med hjälp av en flytande innehavaren cell sond kan utbyta buffert, är det möjligt att kraven assay kofaktor för proteinkomplex bildas. DNA-protein församlingar kan bildas och dissocierade i nära realtid och med när som avbildas. DNA kan genereras med specifika sekvenser av intresse (t.ex. en presumtiv svar element eller nya proteinbindning sekvens), blandat med de hypoteser protein och avbildade att ge direkta bevis för intermolekylära interaktioner.
Knacka läge AFM bildhantering betydligt mindre komplicerat om torra prover tas tillvara i stället för prov i vattenlösningar, och linjär står DNA och slutna cirkeln plasmider DNA har båda varit avbildad på detta sätt 3,9. Den metod som presenteras här utnyttjar prov i buffrad lösningar för att ge en mer fysiologisk bildbehandling miljö. Andra beaktansvärda metoder för avbildning proteiner bör också övervägas, inklusive närområdet infraröd mikroskopi 10. Den kompletterande användning av immunoadsorption i umgås med AFM ger en möjlighet att förbereda en myriad av proteinkomplex med hjälp av väl etablerade biokemiska tekniker, och sedan visualisera dem efter release från immunoadsorbing antikropps-pärla pelleten. Till exempel har immunoadsorbed GR blivit analyserade för sitt samarbete med de molekylära förkläde proteinet hsp70 1 samt dynein motor proteinet 2 som använder denna metod för att uppskatta komplexa storlek och stoichiometries. Partikelstorlek och biofysiska funktioner (t ex stelhet) har varit användbar i fastställa identiteten hos biomolekyler som observerats i AFM avbildas prover 11,12. Det är också möjligt att bekräfta biomolekyler identitet genom tillägg av en samverkande biomolekyler (t.ex. en ligand eller monoklonal antikropp), som skulle binda till sitt mål och orsaka en partikelstorlek öka om målet biomolekyler är närvarande.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health Grant GM086822. Författarna vill tacka Dr. Alec Pakhomov & Paul Wallace (Univ. of Washington nanoteknik användare anläggning (NTUF)) och Andrea Slade (Bruker AXS) för teknisk experthjälp. DNA AFM bildhantering genomfördes vid Univ.. Washington NTUF, en medlem av National Nanotechnology infrastrukturnätverket. Den 2xGal4-2xGRE-luciferease plasmid var vänligt tillhandahålls av laboratoriet av Dr Keith Yamamoto (Univ. of California, San Francisco).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Dimension 3100 | Bruker | Dimension 3100 |
Dimension Fluid Cell | Bruker | DTFML-DD-HE |
Sharp nitride lever (SNL) silicon nitride AFM probe | Bruker | SNL-10 |
Microlever sharp nitride lever (MSNL) silicon nitride AFM probe | Bruker | MSNL-10 |
NanoScope AFM instrument software | Bruker | 004-132-000 |
Metal AFM specimen discs | Ted Pella | 16208 |
Grade V1 Mica Discs, 12 mm | Ted Pella | 50-12 |