Uma variedade de fatores de crescimento e proteínas interagem para induzir as células a assumir os destinos diferentes de células durante o desenvolvimento. Aqui mostramos o uso de um ovo na preparação para enfrentar as possíveis interações entre diferentes proteínas no desenvolvimento, colocando contas em e2.5 embriões de galinha.
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Artigo de método
Fator de Crescimento colocando-Revestido Beads em embriões de galinha Early Stage
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tubo neural expressa em muitas proteínas específicas padrões espaço-temporais durante o desenvolvimento. Essas proteínas foram mostrados para ser crítico para a determinação de célula destino, migração celular e formação de circuitos neurais. Indução neuronal e padronização envolvem proteína morfogenética óssea (BMP), sonic hedgehog (SHH), fator de crescimento fibroblástico (FGF), entre outros. Em particular, o padrão de expressão de Fgf8 está em estreita proximidade com regiões expressar BMP4 e SHH. Este padrão de expressão é consistente com interações de desenvolvimento que facilitam a padronização no telencéfalo.
Aqui nós fornecemos uma demonstração visual de um método em que um ovo em preparação pode ser usado para testar os efeitos de fgfs na formação do cérebro anterior. Grânulos são revestidos com proteína e colocado no tubo neural em desenvolvimento para oferecer a exposição sustentado. Porque o procedimento utiliza pequenas, miçangas cuidadosamente colocados, é minimamente invasivo e permite várias contas para ser colocado dentro de um único tubo neural. Além disso, o método permite o desenvolvimento contínuo de modo que os embriões podem ser analisados em um estágio mais maduro para detectar alterações na anatomia e na padronização neural. Este protocolo simples, mas útil permite a visualização em tempo real. Ele fornece um meio de fazer mudanças espacialmente e temporalmente limitado a níveis de proteína endógena.
Protocolo
1. Retire os ovos da incubadora
Na E2-2.5 (~ 17 St. HH), retire os ovos e prepará-los adequadamente. Eles podem ser trabalhadas imediatamente ou voltou para a incubadora por algumas horas. Os ovos podem ser colocados em temperatura ambiente com segurança por mais de uma hora. Os ovos podem ficar de fora para a duração das manipulações. Às vezes, estes podem levar uma hora ou mais.
Nota: Quanto mais tempo eles ficam em temperatura ambiente, menos provável é que eles são para sobreviver.
2. Preparação de nanquim
- Prepare uma nova solução de 4% de tinta Índia em PBS est....
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Discussão
Dependendo da proteína que você deseja utilizar, existem diferentes protocolos sobre como preparar as contas. Nesses experimentos, usamos heparina em acrílico contas, mas Affi-gel contas também pode ser usado. Descobrimos que as contas heparina em acrílico são mais fáceis de manipular no ambiente aquoso do ovo albumina. Grânulos são embebidos em 5 l de proteína durante a noite a 4 ° C. Esferas de controlo são colocados em PBS estéril até o momento da colocação. A vantagem de usar um ovo na preparação é que o embrião ainda está vivo e livre .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Ovos | Animal | Fertilizados, E2-2,5 (~ Est. 17 HH) | ||
| Incubadora | Profi-I | Lyon | ||
| Tinta da Índia | Ferramenta | Higgins | Preparar uma solução a 4% em PBS estéril. | |
| PBS estéril | Alternativamente, pode-se usar um coquetel de anticorpos | |||
| Seringa de 1 ml | ||||
| Agulhas 27G 1/2 | Ferramenta | BD Biosciences | 305109 | Inclinadas a 90 graus |
| Pinça | Ferramenta | World Precision Instruments, Inc. | tamanho 55 | |
| Hemostatos | ||||
| Tesoura de dissecação | Ferramenta | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8,5 cm |
| Fita de Parafilm | para selar ovos | |||
| Probeta de tungstênio | Ferramenta | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Ferramenta #24. Cabo opcional. |
Referências
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L.
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Reimpressões e permissões
