Antimikrobiell resistensbestämning av Mycobacterium tuberculosis komplex för första och andra linjens läkemedel med buljong utspädning i ett mikrotiterplattan format

Summary

Antimikrobiell resistensbestämning av Mycobacterium tuberculosis är utmanande men avgörande för patientens vård. Detta mikrotiterplatta formatet erbjuder test av 12 mykobakterier droger och ger minsta hämmande koncentration (MIC) värden, som kommer stöd i lämplig behandling.

Abstract

Den snabba detektion av antibiotikaresistens är viktigt i arbetet med att kontrollera ökningen av resistenta Mycobacterium tuberculosis (MTB). Antimikrobiella resistensbestämning (AST) i MTB har traditionellt utförts av agar metoden för proportioner eller genom macrobroth tester på ett instrument som Bactec (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostik, Cleveland, OH) eller BACT / ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). Den agar Andelen metod, medan vara den "gyllene" standard AST, är arbetskraftsintensiv och kräver beräkning av motstånd genom att utföra kolonier på läkemedel som innehåller agar jämfört med drogfria agar. Om det finns ≥ 1% tillväxt på drogen innehåller medelhög jämfört med drogfria medium är organismen anses resistenta mot detta läkemedel. Den macrobroth metoder kräver instrumentering och testa brytpunkt ("kritisk") av läkemedlet för den första raden läkemedel (isoniazid, etambutol, rifampicin och pyrazinamid). Metoden som beskrivs här är kommersiellt tillgänglig i ett 96 väl mikrotiterplattan format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] och innehåller ökande koncentrationer av 12 antibiotika används för behandling av tuberkulos både första (isoniazid, rifampicin, etambutol) och andra droger linje (amikacin, Cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylsyra, rifabutin och streptomycin). Pyrazinamid, är ett första raden drog, ingår inte i mikrotiterplatta på grund av sitt behov av sura testförhållanden. Fördelar med mikroteststrips systemet inkluderar både enkelt installera och snabbare vända tid (14 dagar) jämfört med traditionella agar andel (21 dagar). Dessutom kan plåten sättas upp från inokulat beredd antingen buljong eller fast medium. Eftersom mikrotiterplatta formatet är nytt och sedan MTB presenterar unik säkerhet utmaningar i laboratoriet, kommer detta protokoll beskriver hur säkert att installera, inkubera och läsa mikrotiterplattan.

Protocol

Varje laboratorium måste göra en riskbedömning i samarbete med deras institutionella biologiska säkerhetsansvarige att bestämma lämplig biosäkerhetsnivån för beredning av inokulatet och för pipettering av inokulatet i plattan. I vårt laboratorium använder vi biosäkerhetsnivå 3 laboratorium (BSL3) praxis tills mikrotiterplattor inokuleras, och förseglas med en plast lim tätning. Dessa skyltar placeras sedan i en plastpåse, som värme också tätas. Inkubation och tolkning läsning av mikrotiterplatta bedrivs på ett biosäkerhetsnivå 2 laboratorium (BSL2). 1. Märkning av material Etikett en blodagar platta, tre Middlebrook 7H10 tallrikar, Middlebrook 7H9 buljong, en saltlösning mellan glaspärla röret och en mikrotiter AST tallrik med lämpliga identifieringsmärken (t.ex. patientens namn, journal nummer) i BSL2. Märk blodagar och 7H10 klädd som "renhet check". Regelbunden kolonier av inokulatet rekommenderas för att säkerställa att en lämplig koncentration av organismer används i testet. Kolonier när de utförs måste ha två av 7H10 plattorna märkta med "1 / 1 mikroorganismer" och "1 / 50 kolonier". 2. Technologist förberedelser för att gå in i BSL3 Lämplig personlig skyddsutrustning är nödvändig för att arbeta i BSL3 och inkluderar solida-front klänning, chef täcka, handskar, skoskydd och en respirator. Varje institution bör fastställa sina egna planer andningsskydd i samarbete med deras institutions Industrial Hygiene Officer. I vårt laboratorium har vi flera andningsskydd tillgängliga, inklusive motordrivna andningsskydd luftrenande (PAPRs) och utrustade HEPA-filtreras, N95 halv-face andningsskydd. 3. Beredning av biologisk säkerhet skåpet I BSL3, förbereda den biologiska säkerhetsbänk (BSC) genom att desinficera ytan och placera en pappershandduk fuktad med desinfektionsmedel ca 6 inches från luftventilen panelen. Placera en papperskorg till vänster, och små nephlometer och vortexer till höger. Inokulering loopar pipetors och tips är placerade bredvid pappershandduk. Placera ett rack med organismen (i buljong eller på fast substrat) och McFarland 0,5 standard på hushållspapper. 4. Kalibrering av nephelometer Placera en saltlösning mellan glaspärla röret i nephelometer och ställ in instrumentet till noll med koksaltlösning mellan tomt. Placera McFarland 0,5 standard i nephelometer och kalibrera enligt tillverkarens anvisningar. 5. Beredning av inokulat Arbeta i BSC, skrapa kolonier från fast substrat med en steril ögla i korrekt märkta koksaltlösning mellan glaspärla rör tills en ≥ 0,5 McFarland standard erhålls. Inspektera provet, och jämför med McFarland standard. Vortex prov i 30-60 sekunder. Låt inokulatet att bosätta sig i 15 minuter (ställ en timer). 6. Inokulering av mikrotiterplattan Justera inokulatet med koksaltlösning mellan buljong med nephelometer kalibrerad till McFarland 0,5 i steg 4,1 och 4,2. Detta måste slutföras inom 30 minuter (per tillverkare specifikationer). Använd en 200 mikroliter pipetter och ett långt aerosol resistent pipettspetsen att ta bort 100 mikroliter av inokulat från övre 1 / 3: e av saltvatten pärla mellan röret. Inokulera Middlebrook 7H9 Broth. Sakta virvel de ympade 7H9 buljongen i 20 sekunder. Ta bort AST mikrotiterplattan från tillverkarens paket. Använd inte om torkmedlet är blå eller om foliepåsen förpackningen är skadad. Förbered en 1:50 spädning slang för användning senare i utarbetandet av 1:50 utspädning genom att pipettera 50 mikroliter sterilt vatten i ett sterilt rör. Häll försiktigt den 7H9 buljongen inokulat i ett tråg. Undvik aerosoler. Placera AST mikrotiterplatta med etiketten mot dig. Använd en 12-kanals pipetter för att lägga till 100 mikroliter av inokulatet i varje brunn. Förbered spädningar för kolonier: Den 1 / 1 spädning bereds av den positiva kontrollen väl (H12) med strimmor 1 l ögla på 7H10 skylten märkt "1 / 1". Den 1 / 50 utspädning framställs genom inokulering av en 1 l slinga från den positiva kontrollen bra (H12) och snurra in den i röret med 50 l vatten röret beredd ovan. Streak 1 mikroliter av denna utspädning plattan märkt "1 / 50". Inokulera renhet plåtar från botten genom att pipettera 50 mikroliter på ett korrekt märkta blodagar och 7H10 tallrik och strimmig för isolering. Platsett självhäftande tätning på AST mikrotiterplattan. Tryck ordentligt på varje brunn för att säkerställa tillräcklig tätning med hjälp av den vita baksidan av förseglingen. Undvik veck. Desinficera mikrotiterplatta genom att torka den med hushållspapper indränkt med en tuberculocidal desinfektionsmedel och placera mikrotiterplattan i en plastpåse och förslut med en värmeförseglat eller tejp. Plastpåsen fungerar som ett annat kärl för att säkerställa att all buljong finns bör det finnas en läcka eller spill av de primära plattan. 7. Desinficering av material och biologiska säkerhetsskåp För att undvika att producera aerosoler, placera en annan botten ovanpå inokulerade tråg innan du placerar det försiktigt i kasta behållaren. Desinficera alla material inklusive nephlometer, vortexer, plattor, rör mm genom att torka av med en tuberculocidal desinfektionsmedel och vänta på rätt tillfälle att försäkra desinfektion enligt tillverkarens instruktioner innan du tar bort från BSC. Exempelvis krävs Prospray den tuberculocidal desinfektionsmedel vi använder, 15 minuter för att döda mykobakterier. Placera kasta behållaren i ett biologiskt påse och förslut innan autoklavering. 8. Inkubation Plattorna skall inkuberas med media nedåt och försiktighet bör iakttas för att undvika att spilla eller stänkande vätska. Inkubera AST plattan mikrotiterplatta, 7H10 och blod tallrikar agar i en 35-37 ° C inkubator med 5-10% CO 2 med 5-10% CO 2 i BSL2 laboratoriet. I vårt laboratorium, är detta godtagbart eftersom plattan är väl tillslutna och inuti en förseglad plastpåse. Inte mer än 2 mikrotiter AST plattor bör staplas i inkubatorn enligt tillverkarens anvisningar. 9. Representativa resultat Tolkning av resultaten: Slutna AST mikrotiterplattor kan läsas manuellt med en spegel som ett stöd eller med ett automatiserat plattläsaren som Vizion (TREK Diagnostics). Plattorna kan undersökas så snart som 7 dagar efter ympning. Undersök brunnar tillväxten kontroll i positioner H11 och H12 för att avgöra om de är positiva (dvs. har en deposition på cellerna i botten av brunnen). Om tillväxten kontrollbrunnarna är inte positiva, reincubate plattan och ompröva regelbundet (t.ex., dag 10, dag 14) tills tillväxten kontrollbrunnarna är positiva. Spegel läsa: Placera förseglade AST mikrotiterplattan på plattformen; Läs brunnar tillväxt-kontroll efter 7 dagars inkubation, om detta är negativt, reincubate AST mikrotiterplattan; Om tillväxten kontrollerna är acceptabelt, sedan läsa drogen innehåller brunnar. För varje läkemedel, spela in den första spädningen som inte har någon tillväxt genom att jämföra drogen brunnar med tillväxten kontroll. Tillväxt visas som grumlighet eller en deposition på cellerna i botten av en brunn. Instrument Läs: följ tillverkarens anvisningar, anvisningarna nedan är ett exempel på hur behandlingen skulle göras med Vizion plattformen: Logga in Använd "MYCOTB" AST tallrik programvara. Placera förseglade plattan med streckkoden vänd mot användaren. Tillväxt visas som grumlighet eller en deposition på cellerna i botten av en brunn. Läs tillväxt kontroller, om detta är negativt, reincubate AST mikrotiterplatta, om positiva läsa plattan genom att peka på skärmen med den första brunnen för varje läkemedel som inte visar tillväxt. Läs renhet plattor. Blodet agarplatta ska visa någon tillväxt efter 48 timmar och 7H10 renhet plattan ska ha sammanhängande tillväxt av en organism typ. Om förorenade behöver AST mikroteststrips provning skall upprepas från en ren kultur. Beräkna koloni räknas från den positiva kontrollen och med hjälp av tabellen nedan: Antal mikroorganismer Key # Kolonier räknas på tallriken märkt "1 / 1" # Kolonier räknas på tallriken märkt "1 / 50" Inokulatet Antal mikroorganismer (cfu / ml) <50 0 <5 X 10 4 50-100 0-2 5 x 10 4 till 1 x 10 5 > 100 ≤ 10 1 x 10 5 till 5 X 10 5 > 100 > 10 > 5 X 10 5 Det kan finnas släpande med punkt aminosalicylsyra i vissa stammar av Mycobacterium tuberkuloSIS. Detta kan tolkas genom att titta på alla brunnar som har pellets och med den första brunnen som har samma storlek pellets som nästa utspädning som slutpunkt. Resistens är sällsynt med detta läkemedel. Figur 1. Representativa resultat genom att använda MYCOTB plattan. Drug förkortning Drog MIC μ / ml OFL ofloxacin 16 MXF moxifloxacin 8 RIF rifampicin > 16 AMI amikacin 0,5 STR streptomycin 16 RFB rifabutin 8 PAS p-aminosalicylsyra ≤ 0,5 ETH ethionamide 5 CYC Cycloserine 4 INH isoniazid 2 KAN kanamycin 1,2 EMB etambutol 4,0

Discussion

Ett exempel på en AST mikrotiterplatta som har positiv tillväxt kontroller visas i figur 1 och slutpunkten MIC (mikrogram / ml) för varje läkemedel är inringat. En studie utförd i vårt laboratorium visade att AST mikrotiterplatta metod är likvärdig med den gyllene standarden agar andel metod för resistensbestämning av Mycobacterium tuberculosis. Snabbare rapportering av resultat som erhölls med mikroteststrips AST mikrotiterplatta jämfört med traditionella agar andelen metoden med den slutliga tolkningen för AST mikrotiterplatta och agar andel metoden vid 14 och 21 dagar, har respectively.The AST mikrotiterplatta fördelen att testa först och andra raden läkemedel samtidigt som kan bidra till att förhindra överdrivna förseningar med resistenta stammar. AST mikrotiterplattan är också mycket lättare att ställa in och läsa än APM och både en manuell spegel och en semi-automatiserat system som Vizion kan användas för att läsa skyltar. Tillgången till ett MIC-värde för tbc-resistens testning kan ge värdefull ny information till läkare i förhållande till den traditionella kritiska koncentrationen värde, särskilt för dem isolat med "gränsfall" känslighet.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
AST microtiter plates and adhesive seal	TREK Diagnostics, Cleveland Ohio	MYCOTB
McFarland 0.5 standard	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio	E1041
Middlebrook 7H10 plates	Fisher
Blood Agar Plates	Fisher
Sterile loops 1 μL	Fisher
Sterile loops 10 μL	Fisher
Sensititre Saline-Tween glass bead broth	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio	27143
7H9 OADC Broth	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio	T3440
Long Pipet Tips	Fisher
Sterile Troughs	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio
M. tuberculosis	ATCC	27294
Pipeters: 1000, 200, 20μL	Fisher
Tips 1000, 20, 20 μL	Fisher
Multichannel Pipetter	Fisher
Incubator 5-10% CO2	Fisher
Plastic bags, small, CO2 permeable	Poly Plastic, Delano, PA
TB disinfectant (Such as ProSpray C-60)	Certol International, Commerce City, CO	PSC60/32
Mirror Box Reader	Fisher