Trots den senaste tidens framsteg inom genetisk modifiering förblir transfektion av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) en nyckfull process. Såvitt vi vet har systematiska och effektiva metoder för att transfektera humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) inte rapporterats. Här beskriver vi robusta protokoll för att effektivt transfektera och nucleofect mänskliga iPSCs.
Genetisk modifiering fortsätter att vara ett viktigt verktyg för att studera biologi stamceller och som anger potentiella kliniska tillämpningar av mänskliga embryonala stamceller (hESCs) 1. Medan förbättringar i flera metoder gentillförsel har beskrivits 2-9, förblir transfektion en nyckfull process för hESCs, och har ännu inte rapporterats i humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). I den här videon visar vi hur vårt laboratorium rutinmässigt transfects och nucleofects mänskliga iPSCs med plasmid med en förbättrad grönt fluorescerande protein (EGFP) reporter. Mänskliga iPSCs anpassas och behållas som feeder-fria kulturer för att eliminera möjligheten av feeder-cell transfektion och att möjliggöra en effektiv selektion av stabila transgena IPSC kloner efter transfektion. För nucleofection, mänskliga iPSCs förbehandlas med rock-hämmare 11, trypsiniserades i små klumpar av celler, nucleofected och återutströks på matare i matare cell-konditioneratmedium för att öka cell återhämtning. Transgen-uttryckande humana iPSCs kan erhållas efter 6 timmar. Antibiotikaselektion appliceras efter 24 timmar och stabila transgena linjer visas inom 1 vecka. Vår protokoll är robust och reproducerbar för mänskliga IPSC linjer utan att ändra pluripotens av dessa celler.
Våra protokoll resulterar i enkla, robusta och mycket reproducerbara metoder för att införa transgener i mänskliga iPSCs utan framträdande toxisk effekt och celldöd. Mänskliga iPSCs bör passeras i mindre klumpar av celler (5-10 celler) och utströks på Geltrex vid hög densitet (1:2) för att säkerställa optimal transfektionseffektivitet i många små kolonier. För mänskliga IPSC linjer som är mer benägna att differentiering och celldöd, bör större antal människor iPSCs (upp till 4 x 10 6 celler) användas för en enda nucleofection experiment. Övergående transfektionsanalys genererar stora mängder transgena-uttryckande humana iPSCs inom 1 dag. Stabilt transfekterade IPSC kloner debuterar vanligen inom 7 dagar, och dessa transgena kolonier bör vara redo att plockas inom tre veckor. Användningen av CAG promotor som beskrivs här ger allmänt förekommande uttryck för EGFP reporter. Under sådana förbättringar kan våra protokoll matas in i andra tillämpningar, inklusive överuttryck, cillkorad induktion, härledning av härkomst-specifika reporter linjer, shRNA eller siRNA knockdown, riktad genmodifiering och homolog rekombination.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet beskrivs i detta manuskript har gjorts möjlig genom bidrag från California Institute för regenerativ medicin (CIRM) för UCR Stem Cell Core.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
0.25% Trypsin with EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Glass beads should be washed with hydrochloric acid (HCl) overnight, rinsed off with sodium hydroxide (NaOH) and distilled water, and sterilized by autoclave before use. |
Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
DMEM (high glucose) | Lonza | 12-741 F | |
Fetal calf serum | Invitrogen | 16000044 | |
Geltrex | Invitrogen | 12760013 | Growth factor reduced |
GeneJuice transfection reagent | EMD Biosciences | 70967 | |
Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | L-Glutamine (Invitrogen, 25030081) can also be used instead. |
Human iPSC KOSR media | 500 ml human ES media consists of 390 ml KnockOut DMEM/ F12, 100 ml KnockOut Serum Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 μl 2-Mercaptoethanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. | ||
KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
KnockOut Serum Replacement (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
Mouse embryonic fibroblast media | MEF media consists of 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I and 1X sodium pyruvate in DMEM (high glucose) | ||
Non essential amino acid, NEAA?(100X) | Invitrogen | 11140050 | |
Human stem cell nucleofector solution 1 with supplement | Lonza | VAPH-5012 | |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
Sodium pyruvate (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
STEMPRO medium kit | Invitrogen | A1000701 | 500 ml STEMPRO media consists of 454 ml KnockOut DMEM/ F12, 10 ml STEMPRO serum-free growth supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine serum albumin, 25%), 909 μl 2-Mercaptoethanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. |