Studiet av leveren sinusformet endotelceller (sek) må utføres med primære celler hentet fra dyret som noen cellelinjer eksisterer. Denne metoden er avhengig av leveren fordøyelsen og differensial sentrifugering for SEC rensing for senere dyrking og eksperimentering.
Leveren er den metabolske midten av pattedyr kroppen og fungerer som et filter for blodet. Den grunnleggende arkitekturen av leveren er illustrert i figur 1 der mer enn 85% av leveren massen består av hepatocytter og de resterende 15% av cellulære massen består av Kupffer celler (KCS), stellate celler (HSCs), og sinusformet endotelceller (sek). Sekunder danne blod fartøy vegger i leveren og inneholder spesialiserte morfologi kalt fenestrae innenfor i cytoplasma. Fenestrasjon av cytoplasma er utseendet av hull (~ 100 mikrometer) i cellene slik at Sekunder fungere som en sil hvor de fleste chylomikroner, kylomikron rester og makromolekyler, men ikke celler, går gjennom til hepatocytter og HSCs 1 (Fig. 1). På grunn av mangel på en basalmembran, gapet mellom Sekunder og hepatocytter danner Space of Disse. HSCs okkupere denne plassen og spiller en fremtredende rolle i regulering og svar på injury, lagring av retinsyre og immunoregulation av leveren 2.
Sekunder er blant de mest endocytically aktive celler i kroppen som viser en rekke scavenger reseptorer på celleoverflaten 3. Disse inkluderer SR-A, Stabilin-1 og Stabilin-2. Vanligvis er små kolloidale partikler mindre enn 230 nm og makromolekyler i buffer fase tatt opp av sek, mens store partikler og cellulære rusk er endocytosed (phagocytosed) ved KCS fire. Dermed er mesteparten clearance av ekstracellulært materiale som glycosaminoglycans fra blodet stor grad avhengig av helse og endocytic funksjoner sek 5,6. For eksempel er en økning i blodet hyaluronan nivåer tegn på leversykdom som spenner fra milde til mer alvorlige former 7.
Med unntak av en rapport 8, er det ingen udødeliggjort SEC cellelinjer i tilværelsen. Selv dette udødeliggjort cellelinje er de-differensiertrerte i at det ikke uttrykker scavenger reseptorer som finnes på primære sek (våre data, ikke vist). Alle cellebiologiske studier må utføres på primære celler hentet ferske fra dyret. Dessverre sek dedifferentiate under standard kultur forhold og må brukes innen 1 eller 2 dager etter isolasjon fra dyret. Differensiering av sekunder er preget av uttrykket av Stabilin-2 eller HARE reseptor 9, CD31, og tilstedeværelsen av cytoplasmatiske fenestrasjon 1. Differensiering av sekunder kan utvides ved tilsetning av VEGF i kultur media eller ved dyrkning celler i hepatocytter kondisjonert medium 10,11.
I denne rapporten vil vi demonstrere endocytic aktivitet Sekunder i intakt organ med radio-merket heparin for hyaluronan for SEC-spesifikke Stabilin-2 reseptoren. Vi vil deretter rense hepatocytter og Sekunder fra perfused leveren til å måle endocytose.
Anestesi av rotte ved henging slipp-metoden hvor isofluran damp medføre bevisstløshet er den foretrukne metoden for våre studier. En vaporizer kan også brukes i stedet for en sprøyte med bomull for å opprettholde dyret utenfor kammeret, men den kirurgiske prosedyrer er så rask, det er ikke nødvendig. Polyetylenglykol legges til isofluran for å redusere damptrykk og fordamping rate. For mye isofluran vanndamp vil forårsake døden for raskt. Hvis dyret dør før leveren er cannulated og forvellet med TBS, pooling blodet kan koagulere i leveren og hindre effektiv vask av sinusoids og fordøyelse med collagenase. Tillegg av heparin kan være nyttig som en antikoagulant men er ikke brukt i disse studiene ettersom vi bruker merket heparin som probe vår.
Gey er buffered saltløsning (GBS) er ofte erstattet av andre laboratorier for rensing av sekunder. Mens det er nyttig for SEC rensing, hepatocytes tolererer ikke GBS samt Buffers 1-3 og viabilities er ikke på langt nær så høy. Ved måling endocytose, er det god praksis å måle bakgrunnsnivå i orgelet og i renset hepatocytter.
Denne metoden er en av to for effektiv rensing av Sekunder etter leveren perfusjon med collagenase. Den andre metoden skiller non-parenkymatøs celler ved elutriation sentrifugering 19 istedenfor Percoll gradient. Fordelene for bruk elutriation enn Percoll graderinger blir litt høyere celle viabilities og tall. Ulempen er at elutriation sentrifugering krever en spesialisert rotor, dedikert sentrifuge, og peristaltiske pumper sammen som koster titusenvis av dollar. Denne metoden krever kun bruk av en nedkjølt bordplate sentrifuge og peristaltiske pumper som er standard i mange laboratorier.
Separasjon av sekunder og KCS ved selektiv adhesjon er en standard metode20-22. Mens det er sant at Sekunder vil forholde seg til glass og plast, er nøkkelen for å bruke syre-vasket rent glass med ikke mer enn en 15 minutters inkubasjon ved 37 ° C ved 5% CO 2. KCS vil alltid forholde seg raskere enn sekunder og det er tilrådelig å forsiktig vaske KCS med media å trekke ut eventuelle gjenværende Sekunder som har blitt løst vedlagt. Pronase og andre proteaser er også utelatt fra collagenase fordøyelsen trinnene i denne protokollen for å øke viabilities av cellene. Proteaser fordøye ekstracellulær reseptorer og kan hemme cellulær vedheft i den endelige renselse trinn.
Metoden som presenteres her har et bredt utvalg av applikasjoner. Selv om vi viser sluttresultatet der heparin er i utgangspunktet tas opp for klarering, perfusjon av leveren for å innhente primære hepatocytter, kan KC, sek, og HSCs være nyttig for en rekke studier med metabolske veier, immunoregulation, scavenger aktiviteter, og andre fysiologiske Studies. Den vanskeligste delen av denne prosedyren er god cannulation, fordøyelse av leveren, og håndtering av leveren uten å ha kateteret slip fra portalen blodåre.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Dr. Paul Weigel ved Univ.. of Oklahoma for bruk av monoklonale antistoffer 30 for påvisning av HARE/Stabilin-2 reseptoren og Janet Weigel for henne teknisk assistanse. Denne forskningen er finansiert av University of Nebraska forskningsmidler.
All salts are from Sigma-Aldrich
Name | Company | Model/catalog # | Comment |
20L water bath | ThermoFisher | 2231 | Water is about 45°C to compensate for cooling within the tubing. |
Peristaltic Pump | Cole-Parmer | 7553-70 | Masterflex series |
Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend XTR | |
Catheter | BD Biosciences | 381444 | |
Dessicator chamber | Fisher | 08595E | Use internal plate |
Percoll | Sigma | P4937 | |
Bovine Serum Albumin | SeraCare | AP-4510-01 | |
100 μm mesh | Spectrum labs | 146488 | |
30 μm mesh | Spectrum labs | 146506 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
Polyethylene glycol | Spectrum labs | PO107 |