אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם
Summary
אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.
Abstract
בתגובה לזיהום נגיפי, מארח מפתחת תגובות הגנתיות שונות, כגון הפעלת מסלולי איתות חיסוניים מולדים שמובילים ל1,2 ייצור ציטוקינים אנטי. על מנת ליישב את המארח, וירוסים הם מחייבים להתחמק תגובות מארחות אנטי ולתפעל מסלולי איתות. להתיר את אינטראקצית מארח הווירוס שישפוך אור על פיתוח אסטרטגיות הטיפוליות החדשניות נגד זיהום ויראלי.
Murine γHV68 הוא קשור קשר הדוק לסרקומה הקשורים לוירוס ההרפס של האדם אונקוגני קפוסי וEpsten-Barr וירוס 3,4. γHV68 דלקת בעכברי מעבדה מספקת מודל חיה קטנה צייתן לבחון את כל המהלך של תגובות מארחות וזיהום ויראלי בvivo, אשר אינם זמינים לherpesviruses אדם. בפרוטוקול זה, אנו מציגים פנל של שיטות לאפיון פנוטיפי ונתיחה מולקולרית של רכיבים מארחים איתות בreplic ממוסס γHV68ation בשניהם vivo ו vivo לשעבר. הזמינות של זני עכבר מהונדס גנטי מאפשרת החקירה של התפקידים של מסלולי איתות מארחת במהלך זיהום החריף γHV68 in vivo. בנוסף, fibroblasts העכבר העוברי (MEFs) שבודד מזני העכברים החסרים אלה יכול לשמש כדי לנתח את התפקידים של המולקולות האלה עוד יותר במהלך vivo לשעבר שכפול ממוסס γHV68.
שימוש במבחנים בביולוגיה מולקולרי וVirological, אנו יכולים להצביע על המנגנון המולקולרי של אינטראקציות מארח וירוס ולזהות מארח וגנים נגיפיים חיוני לשכפול ממוסס נגיפי. לבסוף, מערכת מלאכותית כרומוזום חיידקים (BAC) מאפשרת הכנסת מוטציות לגורם ויראלי (הים) שדווקא להפריע אינטראקצית מארח הווירוס. רקומביננטי γHV68 נושא מוטציות אלו יכולים לשמש כדי לסכם את פנוטיפים של שכפול ממוסס γHV68 בMEFs הלקויים במארח מקש איתות רכיבים.פרוטוקול זה מציע אסטרטגיה מצוינת לחקור את אינטראקצית מארח הפתוגן ברמות שונות של התערבות בvivo ו vivo לשעבר.
לאחרונה, גילינו שγHV68 usurps מסלול איתות חיסון מולד לקדם שכפול נגיפי ממוסס 5. באופן ספציפי, דה נובו זיהום γHV68 מפעיל IKKβ קינאז החיסוני וIKKβ הופעל phosphorylates הגורם הראשי הנגיפי שעתוק, השכפול וtransactivator (RTA), כדי לקדם את הפעלת שעתוק נגיפית. בתוך כך, ביעילות γHV68 זוגות הפעלת שעתוקה לארח הפעלת חיסון מולדת, ובכך להקל על שעתוק נגיפי ושכפול מוסס. מחקר זה מספק דוגמה מצוינת שיכול להיות מיושמת על וירוסים אחרים לחקור את אינטראקצית מארח וירוס.
Protocol
Discussion
בתגובה לזיהום נגיפי, שבילים החיסוניים המולדים MAVs תלויי איתות מופעלים כדי לקדם את הייצור של ציטוקינים דלקתיים אנטי 10-14. שימוש γHV68 העכברי כוירוס מודל לסרקומה הקשורים לוירוס ההרפס של האדם אונקוגני קפוסי וEpstein-Barr וירוס 3,4, גילה שγHV68 usurps מסלול MAVs-IKKβ לקדם שכפול …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר ג'יימס (Zhijian) חן (UT Southwestern, ביולוגיה מולקולרית) לאספקת ריאגנטים חיוניים, כולל את MAVs – / – עכברים, ודר 'רן יום ראשון (אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס, פרמקולוגיה ורפואה המולקולרית ) למתן כרומוזום המלאכותי של חיידקי γHV68 למחקר זה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Electro-MAX DH10B competent cells | Invitrogen | 18290-015 |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 |
| POWERPREP HP Plasmid Miniprep System | OriGene | NP100004 |
| POWERPREP HP Plasmid Midiprep System | OriGene | NP100006 |
References
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449, 819-826 (2007).
- Speck, S. H., Virgin, H. W. Host and viral genetics of chronic infection: a mouse model of gamma-herpesvirus pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 2, 403-409 (1999).
- Speck, S. H., Ganem, D. Viral latency and its regulation: lessons from the gamma-herpesviruses. Cell Host Microbe. 8, 100-115 (2010).
- Dong, X. Murine gamma-herpesvirus 68 hijacks MAVS and IKKbeta to initiate lytic replication. PLoS Pathog. 6, e1001001-e1001001 (2010).
- Strauss, W. M., Ausubel, F. M. Preparation of genomic DNA from mammalian tissues. Current Protocols in Molecular Biology. , 2-2 (1998).
- Song, M. J. Identification of viral genes essential for replication of murine gamma-herpesvirus 68 using signature-tagged mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3805-3810 (2005).
- Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J. Mol. Biol. 26, 365-369 (1967).
- Eva-Maria Borst, E., Crnkovic-Mertens, I., Messerle, M., Zhao, S., Stodolsky, M. Cloning of β-herpesvirus genomes as bacterial artificial chromosomes. Methods in Molecular Biology. , 256-256 (2004).
- Sun, Q. The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses. Immunity. 24, 633-642 (2006).
- Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell. 122, 669-682 (2005).
- Kawai, T. IPS-1, an adaptor triggering RIG-I- and Mda5-mediated type I interferon induction. Nat. Immunol. 6, 981-988 (2005).
- Meylan, E. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus. Nature. 437, 1167-1172 (2005).
- Xu, L. G. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling. Mol. Cell. 19, 727-740 (2005).
