Ökad cDNA Avkastningen från encelliga Mängder av mRNA i Standard transkriptas Laboratory Omvänd Reaktioner med akustiska Microstreaming
Summary
Vi beskriver en ny metod för att öka cDNA avkastningen från encelliga mängder av mRNA i övrigt standard transkription laboratorium omvända reaktioner. Det nya finns i användandet av en micromixer, som utnyttjar fenomenet akustiska microstreaming, att blanda vätskor på mikroliter skalor mer effektivt än skakningar, vortexa eller trituration.
Abstract
Korrelera genuttryck med cellens beteende är idealiskt sker på encelliga nivå. Detta är dock inte lätt att uppnå eftersom den lilla mängd labila mRNA som finns i en enda cell (1-5% av 1-50pg totala RNA, eller 0,01-2.5pg mRNA, per cell 1) mestadels degraderar innan det kan vända transkriberas till en stabil cDNA kopia. Till exempel med vanliga laboratoriereagenser och hårdvara, kan bara ett litet antal gener vara kvalitativt bedömas per cell 2. Ett sätt att öka effektiviteten i vanliga laboratorium omvänt transkriptas (RT) reaktioner (dvs standardreagens i mikroliter volymer) som består av encelliga mängder av mRNA skulle vara att snabbare blanda reagenser så mRNA kan omvandlas till cDNA innan det bryts ned. Men detta är inte trivialt eftersom vid mikroliter skalor vätskeflödet är laminärt, dvs för närvarande tillgängliga metoder för att blanda (dvs skakningar, vortexa och trituration) misslyckas med att producera tillräckligt kaotisk rörelse för att effektivt blanda reagenser. För att lösa detta problem, mikro-skala blanda tekniker måste användas 3,4. Ett antal av mikrofabricerade-baserad blandning har utvecklats som framgångsrikt öka RT reaktion ger 5-8. Men mikrofluidik teknik kräver specialiserad hårdvara som är relativt dyra och ännu inte allmänt tillgängliga. Ett billigare, bekvämare lösning är önskvärd. Huvudsyftet med denna studie är att visa hur tillämpningen av en roman "micromixing" teknik för att standarden laboratorium RT reaktioner som består av encelliga mängder av mRNA väsentligt ökar deras cDNA avkastning. Vi finner cDNA skördarna öka med cirka 10 100 gånger, vilket gör att: (1) ett större antal gener som skall analyseras per cell, (2) mer kvantitativ analys av genuttryck, och (3) bättre upptäckt av låg-överflöd gener i enstaka celler. Den micromixing är baserad på akustiska microstreaming 9-12, ett fenomen där ljudvågor sprida runt en liten hinder skapar en medelflödeshastighet nära hindret. Vi har utvecklat en akustisk microstreaming-baserad enhet ("micromixer") med en nyckel förenkling, akustiska microstreaming kan uppnås på ljudfrekvenser genom att systemet har en flytande luft-gränssnittet med en liten böjningsradie 13. Menisken av en mikroliter volym lösning i ett rör ger en tillräckligt liten radie. Användningen av ljudfrekvenser innebär att hårdvaran kan vara billig och mångsidig 13 och nukleinsyror och andra biokemiska reagens inte är skadade som de kan vara med standard laboratorie sonicators.
Protocol
Discussion
Metoden för tillämpning av micromixing till standard laboratorie RT reaktioner som beskrivs här kan naturligtvis innebära mRNA skördade via någon metod (t ex cellslys, laser fånga microdissection). Det kan också uppvisa några märken eller typer av RT reagenser, alla temperaturer (inom tolerans av materialen i micromixer), och varje tidsperiod. Till exempel har vi observerade förbättrats cDNA avkastningen från RT reaktioner som består av slumpmässigt hexamer eller oligo-dT primer. Det kan även tillämpas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien (projektbidrag nr. 6.288.480) och Scobie och Clare MacKinnon Trust.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus, CA, USA | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega | C1181 | |
| AMV-RT | Promega | M5101 | |
| dNTP set | Promega | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystem | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Scientific | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
References
- Livesey, F. J. Brief Funct Genomic Proteomic. 2 (1), 31-31 (2003).
- Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. . Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).
- Ottino, J. M., Wiggins, S. . Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).
- Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. . J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).
- Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. . Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. . Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. . Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. . Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).
- Jiao, Z. J., Huang, X. Y. . Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).
- Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. . Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).
- Paxton, W. F., O’Hara, M. J., Peper, S. M. . Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).
- Autom, L. a. b. . 11, 399-399 (2006).
- Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. . 47 (4), 827-827 (2009).
- Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. . 50 (2), 116-116 (2011).
- Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. . Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).
- Riley, N. Ann Rev Fluid Mech. 33, 43-43 (2001).
- Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. . Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).
