Separazione di DNA a singolo filamento, doppia elica del DNA e RNA da una Comunità Ambientale virale usando la cromatografia idrossiapatite
Summary
Descriviamo un metodo efficace per separare singolo filamento di DNA a doppio filamento di DNA e le molecole di RNA virale ambientale comunità. Gli acidi nucleici sono frazionate mediante cromatografia di idrossiapatite con concentrazioni crescenti di fosfati contenenti buffer. Questo metodo consente l'isolamento di tutti i tipi virali acidi nucleici da campioni ambientali.
Abstract
I virus, in particolare batteriofagi (fagi), sono le entità più numerosi biologica sulla Terra 1,2. I virus modulare cellula ospite abbondanza e la diversità, contribuiscono alla cicli dei nutrienti, alterare ospitare fenotipo delle cellule, e influenza l'evoluzione di entrambi cellula ospite e le comunità virale attraverso il trasferimento laterale dei geni 3. Numerosi studi hanno messo in evidenza la diversità sconcertante genetica dei virus e delle loro potenzialità funzionali in una varietà di ambienti naturali.
Tecniche di metagenomica sono state utilizzate per studiare la diversità tassonomica e le potenzialità funzionali di complessi assemblaggi virale i cui componenti contengono DNA a singolo filamento (ssDNA), DNA a doppia elica (dsDNA) e RNA genotipi 4-9. Attuali protocolli di costruzione della libreria usata per studiare l'ambiente del DNA-RNA contenenti o contenenti virus richiedono un trattamento iniziale nucleasi al fine di rimuovere i modelli nontargeted 10. Tuttavia, una comprensione globale del complemento gene collettiva della comunità virus e la diversità del virus richiede la conoscenza di tutti i membri indipendentemente dalla composizione del genoma. Frazionamento di acido nucleico purificato sottotipi fornisce un meccanismo efficace per lo studio assemblaggi virale senza sacrificare un sottoinsieme della firma genetica della comunità.
Idrossiapatite, una forma cristallina di fosfato di calcio, è stato impiegato nella separazione degli acidi nucleici, così come le proteine e microbi, dal 1960 11. Sfruttando l'interazione tra la carica a carica positiva Ca 2 + ioni di idrossiapatite e la spina dorsale fosfato con carica negativa dei sottotipi acidi nucleici, è possibile eluire preferenzialmente ogni sottotipo di acido nucleico indipendente dagli altri. Recentemente abbiamo utilizzato questa strategia per frazionare in maniera indipendente i genomi di ssDNA, dsDNA e RNA contenenti virus, in preparazione di sequenziamento del DNA 12. Qui, vi presentiamo un metodo per il frazionamento ed il recupero di ssDNA, dsDNA e RNA virale acidi nucleici da assemblaggi misti virale mediante cromatografia in idrossiapatite.
Protocol
Discussion
La metodologia cromatografia idrossiapatite qui presentato è uno strumento altamente efficiente e robusto per il frazionamento degli acidi nucleici da assemblaggi misti virale, quando l'obiettivo è quello di studiare la composizione totale di acidi nucleici della comunità. In generale, ssDNA, RNA e DNA a doppia elica si eluire dalla colonna pho concentrazioni di tampone fosfato maggiore di circa 0.40m 0e ~ rispettivamente. Tuttavia, ogni preparazione di idrossiapatite può avere una composizione leggerme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dall'Ufficio della Scienza (BER), US Department of Energy, Cooperativa accordo no. De-FC02-02ER63453, la National Science Foundation microbica Programma Genome Sequencing (numeri premio 0626826 e 0731916). Ringraziamo Giovanni in vetro per la sua competenza tecnica e di consulenza e K. Eric Wommack per la sua assistenza con la raccolta dei campioni ambientali.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Catalogue Number |
|---|---|---|---|
| Econo-Column | Bio-Rad | 737-0717 | 0.7cm ID package/2 |
| Hydroxyapatite | Bio-Rad | 130-0520 | DNA Grade Bio-Gel HTP Gel, 100g/td> |
| Sodium Phosphate, Monobasic | VWR | VW1497-01 | Monohydrate, Crystal 500g |
| Sodium Phosphate, Dibasic | VWR | VW1496-01 | Anhydrous, Powder 500g |
| DEPC-treated Water | Invitrogen | AM9922 | 1L |
| 10% SDS Solution | Invitrogen | 24730-020 | UltraPure, 1L |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | AM9262 | pH 8.0, 1L |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | |
| 2ml serological pippette | VWR | 89130-884 | Polystyrene, Sterile |
| BD Falcon Centrifuge Tubes | VWR | 21008-936 | 15ml, Sterile |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1 v/v/v) | Invitrogen | 15593-031 | UltraPure, 100ml |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Device | Millipore | UFC803024 | Ultracel-30 membrane |
| 20X TE Buffer, Rnase free | Invitrogen | T11493 | 100ml |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15mg/ml |
References
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