우리는 감염된 세포로부터 고순도 herpesvirus nucleocapsid DNA를 분리하는 과정을 설명합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응, 새로운 바이러스 recombinants 생산 transfections에 적합하고, 높은 집중력과 순결입니다.
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이 논문에서
요약
초록
바이러스는 세포 의무 기생충이며, 따라서 그들의 DNA의 연구는 거리 숙주 세포 오염 물질과 DNA에서 바이러스 물질을 격리가 필요합니다. 여러 다운 스트림 응용 프로그램이 프로토콜에 의해 제공됩니다 순수 바이러스 DNA의 다량을 필요로합니다. 이러한 응용 프로그램은 바이러스성 게놈 호스트 DNA의 제거 바이러스는 시퀀스에 대한 데이터 출력을 최적화하는 데있어 매우 중요합니다 시퀀싱, 그리고 새로운 바이러스 재조합 종자의 생산, 플라스미드 및 선형 바이러스 DNA가 재조합을 용이하게 정화의 공동 transfection. 1,2를 포함 3
이 절차는 extractions와 감염된 세포에서 선형 herpesvirus nucleocapsid DNA를 정제 분리 밀도 기반 원심 분리의 조합을 활용합니다. 4,5 초기 정화 단계 extractions 및 원심 분리 단계 동안 바이러스 DNA를 포함하고 보호하는, 정화 바이러스 capsids을 분리하는 것을 목표로 세포 단백질과 DNA를 제거하는 것이. nucleocapsids의 용해 다음 바이러스 DNA를 출시, 두 최종 페놀 - 클로로포름 단계는 남아있는 단백질을 제거합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 1.90의 평균 OD 280분의 260과 고농도 순수합니다. 사용 감염된 세포, 150-800 μg 이상에서 바이러스성 DNA 범위의 수율의 수량에 따라 다릅니다. 이 DNA의 순도는 4C에서 장기 보관 동안 안정합니다. 이 DNA는 따라서 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응 및 transfections에 적합합니다.
이전 프로토콜을 처음으로, 그것은 요리 당 세포 (예 합류 15cm 접시에 8 X 10 6 PK - 15 세포의 평균) 및 바이러스 주식의 titer를 사용하는 (의 평균 숫자를 아는 것이 중요합니다 ML 당 예 : 1 X 10 8 플라크 형성 단위 -). 이들은 프로토콜에 대한 감염의 적절한 다중성을 (뫄) 계산이 필요합니다. 예를 들어 6, 뫄 5시 위 바이러스 주식과 PK - 15 세포 중 하나 15cm 접시를 감염시킬, 당신은 400 μl를 사용하는 것입니다 매체의 3.6 ML (한 15cm 플레이트 4 ML 총 접종 볼륨)로 바이러스 주식을 희석.
여러 바이러스성 DNA의 준비가 동시에 준비하실 수 있습니다. 동시 준비의 개수는 초원 심 분리기의 회전자에 의해 개최 튜브의 숫자로 제한됩니다 (바이러스 당 하나, 아래 단계 3.9 참조). 여기 한 바이러스에 완료되는 것처럼 절차를 설명합니다.
프로토콜
1. 첫날 : 바이러스성 감염 및 버퍼의 작성
- 감염에 대한 조직 배양 세포의 50-10 요리 (15cm 직경)를 준비, pseudorabies 바이러스 (PRV) 또는 헤르페스에 대한 베로 세포에 대한 예 : PK - 15 세포 (HSV) 바이러스를 단순.
- 세포가 95 때 - 100 % 합류의 (뫄) 50-10에 그들을 감염. 이렇게하려면 강판 당 4 ML의 총 볼륨에서 바이러스 주식을 사용하여 각 접시를 예방하고 37에서 1 시간 동안 접시를 품어 ° C. 록 번호판 부드럽게 매 15 분 셀 monolayer은 바이러스에 의해 완전히 inoculum 코팅 유지할 수 있습니다. 한편, 다음 단계에 대한 매체를 따뜻하게.
- 감염 한 시간 후, 접시에서 바이러스 inoculum을 대기음 따뜻한 중간 15 ML을 추가하고, 37 품어 ° C를 humidified 인큐베이터에 12~20시간하십시오.
- LCM 버퍼 (표 1 참조)과 ° C 철저하게 믹싱을위한 4 박 바위를 준비합니다. (표 2 참조) 바이러스의 DNA resuspension에 대한 TNE를 준비합니다.
2. 둘째 날, 1 단계 : 세포 용해와 Ultracentrifugation
- 시각....
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토론
이 프로토콜의 일부는 원래 BSL4 조건에서 바이러스성 DNA의 격리를 위해 개발하지만, 그것은 비 - BSL 조건에 동등하게 잘 적응했다. 4 우리는 일반적으로 DNA의 genomes를 가지고있는 알파 - herpesviruses PRV과 HSV - 1에서 DNA를 분리하려면이 프로토콜을 사용 capsid와 지질 봉투에 둘러싸인 proteinaceous로 묶여. 7,8 그러나 포함 베타 및 감마 - herpesviruses과 adenoviruses, 가능성이 다른 큰 DNA 바이러스에 직접 적용할 수 있습니다. 비슷한 extractions는 일반적으로뿐만 아니라 RNA 바이러스에 사용됩니다 9.
포함되어있는 정화의 다양한 방법에서이 DNA 준비 가능성이 결과의 견고. 초기 프레온 extractions 변성의 지질 점막, 세포 구성 요소를 분리하고 또한 지질 봉투 및 herpesvirus의 capsids를 둘러싼 바깥.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자 그렉 스미스, 리사 Pomeranz, 매트 라이먼, Marlies 엘드리지, Halina Staniszewska Goraczniak하고, 조정이 프로토콜의 엔키 스트 연구실의 구성원의 기여에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 프레온 (1,1,2 - trichloro - 1 ,2,2 - trifluoroethane) | 어부 | T178 - 4 | 의 적절한 폐기에 대한 지침 프레온 함유 폐기물에 대한 기관에 확인하거나, 멘데즈 외를 참조하십시오. 잠재 프레온 대안. 9 |
| 위상 잠금 겔 튜브, 헤비 15ml 용량 | 5 PRIME | 2,302,850 | 옵션 |
| Polyallomer의 초원 심 분리기 튜브 | 베크맨 * | 331,372 * | 자신의 초원 심 분리기에 적합 * 선택 튜브는, 이들은 한 예로 포함됩니다 |
| NP - 40 / IGEPAL | 시그마 | I - 3021 | |
| PK - 15 세포 | ATCC | CCL - 33 | |
| 베로 세포 | ATCC | CCL - 81 | |
| PBS | HyClone | SH30028.03 |
참고문헌
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E.
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재인쇄 및 허가
