包装艾滋病毒或FIV的基于Lentivector表达结构与VSV-G假型病毒颗粒转导

Summary

慢病毒表达载体的稳定表达不同的效应分子的分裂和非分裂哺乳动物细胞和整个生物体或记者构造最有效的车辆。在这里，我们提供了关于如何打包pseudoviral颗粒lentivector表达结构和转导靶细胞使用pseudoviral颗粒协议。

Abstract

作为标准的载体，它是可能的转染效率低到中等的细胞载体形式的lentivectors获得瞬时表达效应。然而，包装成慢病毒表达pseudoviral颗粒结构，可实现高达100％的转导，甚至小学，干，分化的细胞，如难以转染细胞。此外，慢病毒传递不会产生通常与化学转染，如从转染试剂^1，2的毒性导致细胞死亡相关的特定细胞的反应。当进入靶细胞转，慢病毒结构整合到基因组DNA，并提供小发夹RNA（shRNA的^），3基因的cDNA，小分子RNA或记者^，4稳定表达。可以使用一个可选的标记，如嘌呤或GFP的表达载体的构建中分离靶细胞稳定表达的效应分子。经过PSeudoviral颗粒感染靶细胞，靶细胞内不能复制，因为病毒的结构基因是没有长末端重复序列（公升）被设计成自我失活后转^5，6。

有高效的慢病毒包装^{1，5，6，7}所必需的三个主要组成部分。

1. 慢病毒表达载体，其中包含一些包装所需的遗传因素，病毒表达的稳定整合到基因组DNA构建，表达的效应或记者。
2. 提供蛋白质必不可少的转录和表达的RNA副本包装的慢病毒包装质粒构建成重组pseudoviral颗粒。此协议使用从艾滋病毒或FIV的基因组和水泡性口炎病毒G蛋白（VSV-G的）pPACK质粒（SBI）的编码为插科打诨，POL，转病毒外壳蛋白。
3. 293TN产生 R细胞（来自HEK293细胞）表达SV40大T抗原，这是需要高滴度的慢病毒的生产和新霉素抗性基因，有助于维护细胞重新选择。

病毒生产协议概述图1中可以看出。病毒性生产开始由慢病毒表达载体和包装质粒共转染的的293TN生产者细胞。病毒颗粒分泌到媒体。 48-72小时后收获细胞培养基。从细胞培养基，细胞碎片和病毒颗粒浓度的聚乙二醇，离心沉淀。产生慢病毒颗粒滴度，可用于转导靶细胞。病毒滴定的细节是不包括在此协议，但可以发现：

ANK“> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf ^8。

该协议已被优化使用所表示的特定产品。其他试剂可代替，但不能保证相同的结果。

Protocol

1。 293TN细胞与包装质粒转染和表达建设种子7.0 – 8.0×10 6 293TN细胞每15厘米2 20毫升含DMEM培养基辅以4毫米L-谷氨酰胺，4.5 g / L葡萄糖，不含抗生素的胎牛血清（10％）的文化媒介文化板。成长为18-24小时，在37°C 5％CO 2，使转染时细胞密度达到60-80％汇合。在某些情况下，它可能是必要的种子细胞的几个板块，以获得足够高的靶细胞传导滴度。 对于每一个细胞板，添加1.6毫升的无血清DMEM蒸压2的毫升Eppendorff管。加入45μL的lentivector pPACKH1或pPACKF1和4.5微克建设吸取了DMEM培养液和混合。 添加到同一个管55μLPureFection。涡为10秒。孵育的DMEM-质粒，PureFection混合物在室温温度f或15分钟。 添加下拉明智和漩涡，轻轻均匀地分散在整个板块的组织培养板的DMEM培养液，质粒PureFection混合物。返回菜的孵化器和5％的CO 2增长在37°C。 有没有必要改变转染后的媒体。如果您lentivector结构表示如GFP荧光蛋白基因编码，检查你的细胞，显微镜下转染后12-24小时。你应该能够看到90％的GFP阳性细胞，表明转染成功。 收集到50毫升的无菌离心管细胞培养上清后48和72小时。现在这种细胞培养上清含有传染性pseudoviral颗粒。 （BSL-2类安全工作的建议指引。）离心15分钟，在室温下沉淀细胞碎片1500 XG。病毒上清转移到一个新的管，确保不打扰颗粒。 293TN细胞病毒包装已使用应弃置在生物危害容器，是不被用于进一步几轮病毒包装。 2。病毒上清的浓度新增1卷，冷（4℃）聚乙二醇病毒降水解慢病毒颗粒含上清，每4卷。大量的慢病毒颗粒的沉淀，可以实现与康宁250毫升聚丙烯离心管。反相几次管混合解决方案，但不涡混合物。 冷藏至少12小时的解决方案（长达4天是可以接受的），在4°C。不要摇晃或旋转管在制冷步骤。 离心30分钟，1500 XG上清/聚乙二醇混合物在4°C。慢病毒颗粒离心后，会出现如米色或白色颗粒在试管底部。倒出来的supernataNT。 取下吸液的所有痕迹，注意不要打扰在颗粒沉淀的慢病毒颗粒。残留的PEG的痕迹，它会稀释病毒（从而降低效价），但不会影响靶细胞的完整性，因为聚乙二醇是惰性的，而不是有毒。 用冷（4℃）重悬，并结合原体积的1/100的慢病毒颗粒，无菌磷酸盐缓冲生理盐水或培养液含有25毫米的HEPES缓冲。 分装到无菌低温瓶，直到准备使用储存于-70℃。 3。靶细胞病毒滴定和传导我们建议滴定前转导细胞的利益目标和适当的感染复数（MOI）计算实验之间的一致性的靶细胞的慢病毒颗粒。病毒滴定，我们建议使用HT1080细胞容易感染积极控制线。 PL缓解注意到，滴定协议，涉及与你已经打包的慢病毒颗粒的小等分转导HT1080细胞。滴度是已知的，一旦靶细胞的利益也可以转产生的慢病毒颗粒。一个建议滴定协议，可以发现在： http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7。 板50000每口井的目标细胞的利息在24孔板中的细胞培养基。使用这些细胞通常培养英寸在其指定的培养条件下生长细胞过夜的媒体。细胞应该是转天之间的50至70％汇合。 转天，吸从细胞中的媒体。培养基与TransDux结合终浓度为1×（例如，2.5μL培养基TransDux到500μL）。然后转移的TransDux-CELL培养基混合，以每口井。 吸取了适当的病毒量，对应到每口井的靶细胞的最佳教学语言。如果最佳的教学语言是未知的，我们建议尝试了各种不同的水分（如莫伊容易感染的组织培养细胞，1，2和5和1，10和20为更难以内政部感染原代细胞）。如果慢病毒颗粒的浓度不知道（通过病毒滴定协议确定），不同的病毒量，可以尝试，如1，2和5μL的病毒。病毒与靶细胞可以保持长达72小时的接触。 进一步的实验与转靶细胞的利益可能会开始后，转72个小时，一旦病毒结构已整合到宿主细胞基因组。更改的介质，并根据他们的具体需要，通过靶细胞的利益。 4。代表结果<p类=“jove_step”的293TN细胞转染 293TN细胞密度开始是成功的病毒包装的关键。 293TN细胞必须融合在60 -80％之间的转天（ 图2）。 293TN细胞小于60％汇合，使他们成长为几个小时，然后再尝试转染。如果293TN细胞> 80％汇合，他们应该被转染前replated。 293TN细胞至少有90％如果使用lentivector表达GFP，应该荧光转染后24小时绿色，表明成功转染（ 图3）。如果低于90％的细胞GFP阳性，不进行下一个步骤，因为这表明，没有成功，转染和病毒滴度低。相反，板新293TN细胞并重新启动，使确定，293TN细胞在适当的细胞密度是前染。 293TN细胞可能会拉断的组织培养皿转染后48-72小时。这不会造成负面影响的慢病毒颗粒的生产。 滴定与HT1080细胞履行机构的全球超速滴定试剂盒，根据制造商的指示，可以计算出病毒滴度。该系统采用定量PCR WPRE序列的病毒整合到HT1080细胞的慢病毒载体来衡量和标准曲线进行比较，根据基因组参考序列，精确地测量每毫升传染性单位（图4）。 转导的靶细胞如果使用慢病毒颗粒表达组成性激活的GFP标记，GFP阳性细胞转导12-24小时内开始出现，如果传导反应工作。 GFP表达后应继续稳定的慢病毒结构集成到T他宿主细胞基因组。如果用不同的水分传导，GFP荧光应约匹配的教学语言，在低水分表明GFP荧光和较高的水分表明增加了GFP荧光（ 图5）。 图1。概述病毒的生产协议。混合的lentivector和pPACK包装质粒，并共同为293TN细胞转染。 48 -72小时后，收集病毒上清，用PEG，它沉淀病毒颗粒。滴定慢病毒颗粒后，他们可以使用转导靶细胞的利益。 点击这里查看大图 。 图2。期293TN细胞图像的对比度。细胞density应该是60-80％之间融合转一天。 图3。293TN细胞GFP阳性的荧光图像与Purefection，pPACKH1和结构lentivector编码绿色荧光蛋白转染后24小时。 图4。WPRE qPCR的结果和标准曲线，利用SBI的全球超速滴定套件来计算MOI和相应的滴度包装病毒颗粒。 图5。HT1080细胞荧光图像转慢病毒的数量不断增加。图片是从72小时后转。

Discussion

此病毒的包装和对靶细胞的转​​导协议进行了优化与SBI的病毒包装试剂的使用。其他试剂替代，可能会影响协议的结果。该协议只进行了优化慢病毒生产，未必适合生产病毒或pseudoviruses的其他类型。

病毒包装的成功取决于几个关键步骤。 293TN细胞表达SV40大T抗原，分泌到细胞培养上清的慢病毒颗粒，这是绝对必要的。 293TN细胞在转染时的密度，是为了为PureFection试剂，特别是重要的，充分的lentivector和包装质粒进入细胞转移。添加PureFection混合物彻底旋流板下拉明智地组织培养板，是重要的，分散的包装质粒和lentivector构建整个细胞。未能适当分发的载体，可能会导致生产不足的慢病毒颗粒。病毒的包装反应，可以扩大生产高滴度的病毒，组织培养皿的表面面积的基础上。一个可以选择每293TN细胞结构，需要包装的几个组织培养皿板。病毒上清的浓度，尤其是有助于建立高滴度的病毒。可以结合多个板细胞病毒上清，并集中在体内实验中使用的，或难以转导的细胞。

重要的是计算准确的教学语言使用的靶细胞转导滴定产生的慢病毒颗粒。了解教学语言，用于在一个给定的传导，使解决事件，是不会成功的转。例如，使用的教学语言是过低可能会导致在极少数的目标细胞表达的利益结构。使用1教学语言，是太高了，但是，可能会导致靶细胞，表明压力的迹象。我们的目标是使用1内政部最大化的利益结构的表达，同时保持健康的细胞。虽然我们建议qPCR可以基于的滴定协议措施，在HT1080细胞的慢病毒结构的综合副本，也可以用于其他滴定方法，如P24 ELISA或GFP阳性细胞的百分比估计。

成功转导的靶细胞也取决于几个关键因素。 TransDux是一个独特的感染试剂，使转导效率高，但就是没有细胞毒性。可以用来代替TransDux凝聚胺，这往往是有毒的靶细胞。在靶细胞的转​​列入TransDux帮助，以消除病毒颗粒的指控，并允许进入细胞的病毒第由于TransDux是没有毒性的细胞，可以让慢病毒颗粒与细胞接触中保持长达72小时（已整合到宿主细胞基因组病毒结构的时间），从而增加了概率病毒粒子进入细胞。对于一些难以转导的细胞，转导，可重复连续几天，以提高转染效率。例如，转导，第1天的细胞，使细胞得到休息，第2天，然后再次转导第3天的细胞。重要的是等待72小时后，最后传递开始之前选择，进一步的实验或靶细胞的特性。

高效的病毒包装也依赖于慢病毒结构的大小，5'和3'LTR地区之间。慢病毒构造的这一部分应该是大约900 KB或更少，这相当于本地的艾滋病毒基因组的大小。超过5月的9 KB增加生产pseudoviral颗粒滴度。 piggyBac转座子载体，如新技术，可靠，稳定的外源基因整合到100 KB通过一个单一的转让。这种方法可用于超过大小限制的情况下，它是可能的转染靶细胞，慢病毒载体的结构，并提供病毒包装步骤^9,10不需要额外的好处。

粒子产生的pseudoviral使用此协议是传染病，因为它们可以感染大多数哺乳动物细胞类型。然而在本协议所使用的产品，是第三代，他们生产的非复制和自我失活pseudoviruses BIOSAFE。因此，一旦转成靶细胞或动物，靶细胞或动物是没有传染性或传染性。其他不属于第三代BIOSAFE lentivector质粒换人是可能的，虽然不是从生物安全的建议的观点。应进行病毒生产协议，并随后转导的靶细胞在生物安全等级2，根据NIH的准则^11，和研究人员应该处理的病毒粒子时，总是穿白大褂和手套。使用293TN生产者细胞，病毒颗粒，并一次性移液器管应弃置在适当的生物危害容器。可重复使用的移液器和玻璃器皿应该用漂白粉进行消毒和灭菌，以减少人员暴露。

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM High Glucose Medium	Gibco	11995-073
293TN Cells	SBI	LV900A-1
pPACKH1	SBI	LV500A-1	For HIV-based lentivectors
pPACKF1	SBI	LV100A-1	For FIV-based lentivectors
Any Lentiviral vector	SBI	Various	cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters
PureFection	SBI	LV750A-1 LV750A-5
PEG-it	SBI	LV810A-1 LV825A-1
Global UltraRapid Titering kit	SBI	LV961A-1	Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles
TransDux	SBI	LV850A-1