Expansión de la sangre periférica humana de células T γδ con zoledronato

Summary

Un método para expandir las células T γδ a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se describe. PBMC derivados de las células T γδ se estimulan y se expandió con zoledronato y la interleucina 2 (IL-2). La expansión a gran escala de las células T γδ se puede aplicar a la inmunoterapia celular autólogo de cáncer.

Abstract

Humanos γδ células T pueden reconocer y responder a una amplia variedad de estrés inducido por antígenos, por lo tanto el desarrollo de una amplia actividad innata anti-tumoral y anti-infecciosos. ¹ La mayoría de las células γδ T en sangre periférica tienen el receptor de células T Vγ9Vδ2. Estas células reconocen al antígeno en un complejo mayor de histocompatibilidad-de manera independiente y desarrollar una fuerte funciones efectoras citolítica y como ^Th1-1. Por lo tanto, las células γδ T son células efectoras candidato atractivo para la inmunoterapia del cáncer. Vγ9Vδ2 células T responden a phosphoantigens ejemplo, (E)-4-hidroxi-3-metil-but-2-enil pirofosfato (HMBPP), que se sintetiza en las bacterias a través de la biosíntesis de isoprenoides, ² y isopentenil pirofosfato (IPP), que se produce en las células eucariotas a través de la vía del mevalonato. ³ En condiciones fisiológicas, la generación de IPP en células no transformadas no es suficiente para la activación de células T γδ. La desregulación de la vía del mevalonato en las células tumorales conduce a la acumulación de la IPP y la activación de las células T γδ. ³ Porque aminobisfosfonatos (como pamidronato o zoledronato) inhiben la farnesil pirofosfato sintetasa (FPPS), la enzima actúa aguas abajo de la IPP en la vía del mevalonato, los niveles intracelulares de IPP y sensitibity a γδ T reconocimiento de las células pueden ser terapéuticamente aumentó aminobisfosfonatos. IPP acumulación es menos eficiente en las células nontransfomred que las células tumorales con una concentración farmacológicamente relevantes de aminobisfosfonatos, que nos permiten la inmunoterapia para el cáncer mediante la activación de las células T γδ con aminobisfosfonatos. ⁴ Curiosamente, IPP se acumula en los monocitos al PBMC se tratan con aminobisfosfonatos, debido a la eficiente absorción del fármaco por estas células. ⁵ monocitos que se acumulan IPP ser células presentadoras de antígeno y estimular Vγ9Vδ2 las células T en la sangre periférica. ⁶ Basado en estos mecanismos, hemos desarrollado una técnica para la expansión a gran escala de cultivos de células T γδ con zoledronato y la interleucina -2 (IL-2). ⁷ Otros métodos para la expansión de las células T γδ utilizar el sintético de pirofosfato phosphoantigens bromhidrina (BrHPP) ⁸ o 2-metil-3-butenil-1-pirofosfato (2M3B1PP). ⁹ Todos estos métodos permiten ex la expansión in vivo, lo que resulta en un gran número de células T γδ para su uso en inmunoterapia adoptiva. Sin embargo, sólo el zoledronato es un reactivo aprobado por la FDA disponibles en el mercado. Zoledronato-ampliado las células T γδ pantalla CD27 ^– CD45RA ^– fenotipo efectoras de memoria y su función puede ser evaluado por el IFN-γ ensayo de producción de ^7.

Protocol

1. Aislamiento de PBMC Extracción de sangre (7,5-8,0 ml) en un tubo BD Vacutainer CPT preparación celular con heparina sódica. El tubo contiene un anticoagulante con heparina sódica y un fluido de densidad de Ficoll-Hypaque, además de una barrera de gel de poliéster, que separa los dos líquidos. Tubo de centrífuga / muestra de sangre a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) en un rotor horizontal (se gira hacia fuera de la cabeza) durante 20 minutos a 1800 x g. Interruptor de centrífuga de…

Discussion

El método aquí presentado permite la expansión eficiente de las células T γδ a partir de PBMC. γδ células T activadas y ampliado por zoledronato y la IL-2 desarrollan completar las funciones efectoras, se refleja en la producción de citocinas y citotoxicidad. Se ha informado de que el sintético phosphoantigens pirofosfato bromhidrina (BrHPP) y 2-metil-3-butenil-1-pirofosfato (2M3B1PP) también ampliar las células T γδ, sin embargo, no están disponibles comercialmente. En contraste, el zoledronato es que y…

Materials

Reagent name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
ZOMETA	Novartis Pharma K. K		zoledronate
PROLEUKIN	Novartis Pharmaceuticals		human recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin	BD	362753
RPMI1640	Invitrogen	21870-076
ALyS203- medium	Cell Science & Technology Institute	0301-7
OpTmizer	Invitrogen	0080022SA
brefeldin A	Sigma	B5936-200UL
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma	P1585-1MG
ionomycin	Sigma	13909-1ML
IntraPrep	BECKMAN COULTER	A07803
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07746 FITC A07749 PE/Cy5
anti-human CD4-ECD	BECKMAN COULTER	6604727
anti-human CD8-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	6607011
anti-human CD14-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07765
anti-human CD19-PE	BECKMAN COULTER	A07769
anti-human CD45-ECD	BECKMAN COULTER	A07784
anti-human CD56-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07789
anti-human TCRαβ-PE	BECKMAN COULTER	A39499
anti-human TCR Vγ9-FITC	BECKMAN COULTER	IM1463
anti-human CD27-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	6607107
anti-human CD45RA-ECD	BECKMAN COULTER	IM2711
anti-human CD69-PE	BD	555531
anti-human NKG2D-PE	BECKMAN COULTER	A08934
Anti-humal IFNγ-PE	BECKMAN COULTER	IM2717U
Mouse IgG1 isotype control-PE	BECKMAN COULTER	A07796
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07797 A07798