Expansion du sang périphérique humain cellules T γδ utilisant zolédronate

Summary

Une méthode pour développer des cellules T γδ à partir des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) est décrite. PBMC dérivés des lymphocytes T γδ sont stimulés et étendu en utilisant le zolédronate et l'interleukine-2 (IL-2). L'expansion à grande échelle de cellules T γδ peuvent être appliquées à l'immunothérapie cellulaire autologue de cancer.

Abstract

L'homme des cellules T γδ peuvent reconnaître et répondre à une grande variété de stress induit par les antigènes, développant ainsi une large activité innée anti-tumorale et anti-infectieux. ¹ La majorité des cellules T γδ dans le sang périphérique ont le récepteur des cellules T Vγ9Vδ2. Ces cellules reconnaissent un antigène dans un complexe d'histocompatibilité majeure manière indépendante et de développer de solides cytolytique et Th1-like fonctions effectrices. ^{1 Par} conséquent, γδ lymphocytes T sont des cellules effectrices candidat intéressant pour l'immunothérapie du cancer. Vγ9Vδ2 cellules T de répondre à phosphoantigènes tel que (E)-4-hydroxy-3-méthyl-but-2-ényle pyrophosphate (HMBPP), ce qui est synthétisée dans la bactérie via la biosynthèse des isoprénoïdes; ² et isopentényl pyrophosphate (IPP), qui est produite dans les cellules eucaryotes par la voie du mévalonate. ³ Dans l'état physiologique, la génération des IPP dans la cellule non transformée n'est pas suffisant pour l'activation des cellules T γδ. Le dérèglement de voie du mévalonate dans les cellules tumorales conduit à l'accumulation des IPP et γδ lymphocytes T d'activation. ³ Parce aminobisphosphonates (comme le pamidronate ou zolédronate) inhibent farnésyl pyrophosphate synthase (FPPS), l'enzyme agissant en aval de la PIP dans la voie du mévalonate, les taux intracellulaires de IPP et sensitibity aux cellules T γδ reconnaissance peut être thérapeutique augmenté de aminobisphosphonates. IPP accumulation est moins efficace dans les cellules nontransfomred que des cellules tumorales avec une concentration pharmacologiquement pertinentes de aminobisphosphonates, qui nous permettent d'immunothérapie pour le cancer en activant les cellules T γδ avec aminobisphosphonates ^4. Fait intéressant, IPP s'accumule dans les monocytes lors PBMC sont traitées avec aminobisphosphonates, en raison de l'efficacité l'absorption des médicaments par ces cellules. ⁵ monocytes qui s'accumulent IPP deviennent cellules présentatrices d'antigène et stimuler Vγ9Vδ2 cellules T dans le sang périphérique. ⁶ Basé sur ces mécanismes, nous avons développé une technique à grande échelle l'expansion des cultures de cellules T γδ utilisant zolédronate et l'interleukine -2 (IL-2). ⁷ D'autres méthodes pour l'expansion des cellules T γδ utiliser le pyrophosphate bromhydrine synthétiques phosphoantigènes (BrHPP) ⁸ ou 2-méthyl-3-butényle-1-pyrophosphate (2M3B1PP) ^9. Toutes ces méthodes permettent ex l'expansion in vivo, ce qui entraîne un grand nombre de cellules T γδ pour une utilisation en immunothérapie adoptive. Toutefois, seul le zolédronate est un réactif approuvé par la FDA disponible commercialement. Zolédronate-élargi γδ lymphocytes T CD27 écran ^– CD45RA ^– phénotype mémoire effecteurs et leur fonction peut être évaluée par l'IFN-γ test de production ^7.

Protocol

1. Isolation des PBMC Prélever le sang (7,5 à 8,0 ml) dans un tube BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec de l'héparine de sodium. Le tube contient un anticoagulant héparine sodique et d'un fluide de densité Ficoll-Hypaque, plus une barrière de gel de polyester, qui sépare les deux liquides. Centrifuger le tube / échantillon de sang à température ambiante (18 ° C à 25 ° C) dans un rotor horizontal (swing-out tête) pendant 20 min à 1800 x g. Commutateur centrifugeuse f…

Discussion

La méthode présentée ici permet l'expansion efficace des cellules T γδ partir des PBMC. γδ cellules T activées et élargies par le zolédronate et IL-2 développent complète des fonctions effectrices, reflétée par la production de cytokines et la cytotoxicité. Il a été rapporté que le pyrophosphate bromhydrine synthétiques phosphoantigènes (BrHPP) et le 2-méthyl-3-butényle-1-pyrophosphate (2M3B1PP) élargira également les cellules T γδ, mais ils ne sont pas disponibles dans le commerce. En reva…

Materials

Reagent name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
ZOMETA	Novartis Pharma K. K		zoledronate
PROLEUKIN	Novartis Pharmaceuticals		human recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin	BD	362753
RPMI1640	Invitrogen	21870-076
ALyS203- medium	Cell Science & Technology Institute	0301-7
OpTmizer	Invitrogen	0080022SA
brefeldin A	Sigma	B5936-200UL
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma	P1585-1MG
ionomycin	Sigma	13909-1ML
IntraPrep	BECKMAN COULTER	A07803
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07746 FITC A07749 PE/Cy5
anti-human CD4-ECD	BECKMAN COULTER	6604727
anti-human CD8-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	6607011
anti-human CD14-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07765
anti-human CD19-PE	BECKMAN COULTER	A07769
anti-human CD45-ECD	BECKMAN COULTER	A07784
anti-human CD56-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07789
anti-human TCRαβ-PE	BECKMAN COULTER	A39499
anti-human TCR Vγ9-FITC	BECKMAN COULTER	IM1463
anti-human CD27-PE/Cy5	BECKMAN COULTER	6607107
anti-human CD45RA-ECD	BECKMAN COULTER	IM2711
anti-human CD69-PE	BD	555531
anti-human NKG2D-PE	BECKMAN COULTER	A08934
Anti-humal IFNγ-PE	BECKMAN COULTER	IM2717U
Mouse IgG1 isotype control-PE	BECKMAN COULTER	A07796
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5	BECKMAN COULTER	A07797 A07798