从人类乳腺成纤维细胞癌相关的成纤维细胞的实验发电（CAFS）
Summary
癌相关成纤维细胞（CAFS）在肌纤维母细胞肿瘤间质内的丰富，推动肿瘤进展发挥了重要作用。从人类乳腺成纤维细胞的实验产生CAFS我们开发了一个coimplantation肿瘤xengraft模型。协议描述了如何建立非洲足联的肌纤维母细胞的获取能力，以促进tumourigenesis。
Abstract
癌肿瘤细胞和非癌变的车厢称为“基质”组成的复杂的组织。基质由细胞外基质（ECM）和各种间质细胞，包括成纤维细胞，肌纤维母细胞，内皮细胞，周细胞和白细胞1-3。
肿瘤相关基质是邻近的肿瘤细胞释放大量的旁分泌信号作出反应。在疾病的过程中，基质往往成为人口，包括大量的肌纤维母细胞癌相关成纤维细胞（CAFS）。这些细胞先前已提取他们在体外培养来自许多不同类型的人类癌的。一个亚群水产科学研究院是通过上调α-平滑肌肌动蛋白（α- SMA）的表达4,5区别。这些细胞是一种“激活成纤维细胞”的标志，与肌纤维母细胞彗星类似物业ommonly观察受伤和纤维化组织6。这种肌纤维母细胞非洲足联子集的存在是高度相关，高品位的恶性肿瘤，并与患者的不良预后相关。
许多实验室，包括我们自己，已经表明，咖啡馆，当肿瘤细胞注射到免疫缺陷小鼠，能够大大促进tumourigenesis 7-10。然而，从癌患者准备的咖啡馆，经常接受各地正在进行的实验使用的广泛性，传播文化的限制期间衰老。为了克服这个困难，我们开发了一种新技术，对实验产生永生非洲足联的人类乳腺细胞株人乳腺成纤维细胞（EXP – CAFS），使用coimplantation乳腺肿瘤异种移植模型。
为了生成EXP -水产科学研究院，父母的人乳腺成纤维细胞，减少隆乳组织获得，分别为第一immortaliSED与端粒酶，端粒酶全酶的催化亚基，并表达GFP和嘌呤霉素抗性基因工程。 coimplanted与MCF – 7人乳腺癌表达小鼠异种移植成一个激活的ras癌基因（MCF – 7 – ras基因细胞）的细胞，这些细胞。最初注射的人乳腺成纤维细胞体内孵化期后，分别提取其嘌呤霉素抗性11的基础上，在肿瘤异种移植。
我们观察到，居民人乳腺成纤维细胞分化，采用肌纤维母细胞表型和后天在肿瘤进展过程中促进肿瘤的性质。重要的是，这些细胞，定义EXP – CAFS，密切模仿从乳腺癌患者解剖隔离CAFS的肿瘤促进肌纤维母细胞表型。因此，我们的肿瘤异种移植派生EXP – CAFS提供一个有效的模型来研究人类breas的生物学水产科学研究院吨癌。所描述的协议也可以用于生成和表征各种非洲足联衍生出其他类型的人类癌的人群扩展。
Protocol
Discussion
非洲足联特定的标记和异质性水平缺乏观察，其中包括水产科学研究院提供的这种类型的细胞的特性本身就是一个挑战。 在体外研究水产科学研究院也已阻碍了新的复杂情况，这些细胞衰老停止增殖，长期培养。我们以前尝试直接immortalise使用端粒酶逆转录病毒基因构造的主要水产科学研究院是不成功的。因此，要进一步研究肿瘤促进这些细胞的特性，我们开发了一种方法来生成使用coimpla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢慷慨支持和监督这项工作，并为这篇稿子的关键编辑基兰Mellody先生（英国曼彻斯特大学，曼彻斯特）罗伯特A ·温伯格博士（怀特黑德生物医学研究，剑桥研究所）。这个项目得到了英国研究（CR英国）授予数量C147/A6058（AO）
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | ||
| Fetal calf serum | GIBCO | 10270 | ||
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Collagenase type I | Sigma | C0130-1G | ||
| hyaluronidase | Sigma | H4272 | ||
| Vimentin (V9) antibody | Novocastra Laboratories | NCL-L- VIM-V9 |
||
| Tenascin C (BC-8) antibody | a gift from |
|||
| α-SMA-Cy3 (1A4) antibody | Sigma | C6198 | ||
Prolyl-4-hydroxylase |
Dako | M0877 | ||
| (5B5) antibody | ||||
| Collagen type1 1A antibody | Sigma | HPA011795 | ||
| Pan-cytokeratin antibody | Sigma | C5992 | ||
| Fibronectin antibody | BD Biosciences | 610077 | ||
S100A4/FSP-1 (fibroblast- specific protein-1) antibody |
Dako | A5114 | ||
Fibroblast surface protein (clone 1B10) antibody |
Abcam | ab11333 | ||
| MSCV-IRES-GFP construct | Request to the the authors | |||
| pBabe-puro construct | Purchase from Addgene |
|||
| Puromycin | Sigma | P8833 | ||
| DAPI | Sigma | D9564 | ||
| 15 ml conical tube | Corning | 430766 | ||
| Nude mouse | Taconic | NCRNU-F | Female NCr nude | |
| C3H/10T1/2 cells | ATCC | CCL-226 |
References
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